Buzdolabı : Besiyerlerinin ve hazırlanan petrilerin bozulmasını önlemek için kullanılır.
Etüv : Mikrobiyal gelişime gözlenebilmesi için uygun sıcaklık sağlar.
Mikrodalga Fırın : Besiyerlerinin sterilizasyonundan önce agarları eritmek amacıyla kullanılır.
Su Banyosu : Hazırlanan donmuş besiyerlerinin eritilmesi için kullanılır.
Otoklav : Besiyeri ile çözeltileri sterilize etmek ve yıkama öncesi kirli malzemeyi sterilize etmek için kullanılır. Sterilize edilecek malzeme otoklav iç çeperlerine değmeyecek ve hava akımına izin verecek şekilde doldurulmalıdır.
Stomacher : Çözelti eklenen numunelerin parçalanmasını ve homojenizasyonunu sağlayan alettir.
Vorteks : Deney tüplerinin tam olarak kolayca karıştırılmasını sağlar.
Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı : Karıştırma hızı ayarlanabilen termostatlı bir cihazdır.
Ph metre : Asitliği ölçme amaçlı kullanılan laboratuar aletidir.
Membran Filtrasyon Cihazı : Su tayininde kullanılan laboratuar aletidir.
Hassas Terazi : Numunelerin ve besiyerlerinin tartılmasında kullanılır.
Mikroskop : Görülemeyecek kadar küçük cisimleri mercek yardımıyla büyütüp görülmesini sağlayan alettir.
Eliza Cihazı : Et karışımları için tür tayinde kullanılan laboratuar aletidir.
Pipetör : Deney tüplerinde hazırlanan besiyerlerinin veya çözeltilerin istenen miktarda aktarılmasını sağlar.
Koloni Sayacı : Petrilerde üreyen mikroorganizmaların kolonilerinin sayımı için kullanılan alettir.
Laboratuar Bölümleri :
Besiyeri Tartım Odası : Bu bölümde dehidre besiyerlerinin tartılması ve saf su ile ıslatılması gerçekleştirilir. Hava akımının olmadığı bir odadır. Odanın steril kalmasına dikkat edilmektedir.
Numune Alım Bölümü : Firmalardan steril ortamlarda alınmış olan ürünlerden mikrobiyolojik analiz yapılmak için belirli miktarlarda örnek alınır ve çözelti hazırlanır. Stomacher yardımıyla çözeltinin homojenizyonu sağlanır.
Ekim Odası : Alınan numuneler firmanın isteğine göre belirli analizleri yapmak üzere belirli besiyerlerine ekim yapılır.
Steril Kabin : İlk ekimden ya da ön zenginleştirmeden sonra geçişler bu bölümde yapılır.
Su Analiz Bölümü : Firmaların isteğine göre suyun analiz edildiği bölümdür.
Değerlendirme Odası : Mikroorganizmaların sayılıp, hesaplamaların yapıldığı bölümdür. Aynı zamanda etüv odasıdır.
Yıkama ve Sterilizasyon Bölümü: Bu bölümde bulaşık ve çamaşır makinesi, iki kurutma dolabı, iki otoklav, su distile cihazı bulunmaktadır. Laboratuardan çıkan kullanılmış petriler, kavanozlar, numuneler sterilize edildikten sonra atık toplama ekibine teslim edilir. Su distile cihazı ile saf su üretimi gerçekleştirilir.
Numune Alımı :
Su Numunesi Alımı : Denetime gidilen işletmede önce klor tayini için tüpe su alınır ve 4-5 damla ortotoudin damlatılıp çalkalanır. Eğer numunede klor varsa sarı rengi alır. Son renk skaladan bakılarak su içerisindeki klor miktarı ppm olarak belirlenir. Klor tayininden sonra numune almak için bek alevi yakılır. Alevin yanında alkol ile steril edilmiş musluktan steril şişeye numune alınır. Şişenin üzerine işletme adı ve tarih not düşülür.
Hava Kontrolü : İşletmelerdeki havanın kontrolü için air sampler denen cihazla numune alınır. Cihaz çeşitli, hacme göre ayarlanabilmektedir. Cihaz çalışırken ortamda kimse bulunmamalı ve kapılar kapalı olmalıdır. Sterile edilmiş cihaz kapağının altına PCA ve DRBC agarın bulunduğu petri kaplarına işletme adı ve tarih not düşülür. PCA besiyeri 37 C de 24 saat, DRBC 25 C ‘de 5 gün süreyle inkübasyona bırakılır.
Son Ürün Numunesi Alımı : Denetlenen işletmenin ürettiği bir ürün numune alınarak, bozulmaması için soğuk zincirde laboratuara taşınır. Bu işlem sırasında kesinlikle işletmelerin ekipmanları kullanılmaz ve steril kaşık, kavanoz ve bıçak kullanılır. Alınacak numune bek alevi yanında steril kavanozlara alınır. Kavanoz üzerine işletme adı, tarih not düşülür.
Girdi Numunesi Alımı : İşletmelerde üretimde kullanılacak maddelerden numune alınarak analiz yapılması istenebilir. İşletmeler hangi hammaddenin denetlenmesini istiyorsa ondan numune alınır. Analiz yapılacak hammadde küçük paketlerdeyse paket ile, büyük paketlerde ise bek alevi yanında numune alımı yapılır. Kavanoz üzerine işletme adı, tarih not düşülür.
Swap Testi : İşletmelerde personel hijyen swap testi ve ekipman hijyen swap testi isteğe göre uygulanır. Swap tüpten çıkarılır, temizliği kontrol edilecek yüzeye sürülür. Daha sonra swap tekrar tüpe yerleştirilir. Tüp üzerine işletme adı, personel yada ekipman adı, tarih not düşülür.
Sıcaklık ve nem kontrolü : Denetimler sırasında üretim alanının sıcaklık ve nem ölçümü hassas kollu bir cihazla yapılmaktadır. Kesin ölçüm için ölçüm yapılan alanda bu hassas kollar saklanır. Her yerden ölçümler alınarak son ortalama değer hesaplanır ve değerler raporla birlikte işletmeye sunulur.
Besiyerleri
Hafta başlarında gerekli besiyerleri ihtiyaca göre hazırlanır. Eksilmesi durumunda ihtiyaç olan besiyerleri takviye edilebilir.
Besiyerinin Hazırlanması :
Laboratuarlarda kullanılan besiyeri, dehidre formdan hazırlanır. Her besiyeri kutusunda, kataloğunda ya da prospektüsünde, o besiyerinin nasıl hazırlanması gerektiği yazmaktadır.
Bu amaçla, gereken miktar dehidre besiyeri tartılıp, üzerine saf su eklenir.
Tartım besiyerlerinin saklanacağı 250ml, 500ml ve 1000 ml’ lik sterilize edilmiş schot şişelerine yapılır. Kullanılan spatül sterilize edilmiş olmalıdır.
Tartım sonrasında terazi dezenfektan ile silinerek temizlenmelidir.
Besiyerine ilave edilecek su sterilize edilmiş dereceli mezür ile ölçülür. Ölçülecek suyun hacmi ile mezürün hacmi birbirine yakın olmalıdır.
Ölçülen saf su tartım yapılmış schotlara eklenir ve çalkalanarak besiyerinin erimesi sağlanır.
Bazı besiyerleri soğuk suda elle hafifçe bir çalkalama sonunda tümüyle eriyebilir. Bazı besiyerleri ise eritilmeleri için mutlaka ısıtılmalarına gerek vardır. Agarlı besiyerleri, önce agarın erimesini sağlayacak şekilde ısıtılmalıdır. Bunun için mikrodalga fırın kullanılır.
Mikrodalga fırın ani ısınmalara ve kaynamalara neden olacağı için dikkatli kullanılması gerekir. Özellikle düşük miktarda agar içeren besiyerleri eritme sırasında aniden kaynayarak kaptan taşabilir.
Besiyerinin kaynadığının görülmesi, agarın eridiği anlamına gelmez. Bu nedenle mikrodalga fırın kullanılarak eritme yapıldığında, erlen veya schot iç çeperinde agar ya da diğer besiyeri partiküllerinin kalmadığından emin olunmalıdır. Partiküller gözlenirse yeniden karıştırılmalı ve tekrar mikrodalga fırına konulmalıdır.
Otoklavlama öncesi ısıtarak eritme dikkatli yapılması gereken bir iştir. Sürekli karıştırılarak yapılmalıdır. Aksi halde tam erimemiş partiküllerin yanmasına neden olunabilir. Besiyeri hafifçe çalkalandığında iç çeperde partikül kalmaması erimenin tam olarak gerçekleştiğini gösterir.
Hazırlanan erimiş besiyerleri otoklavda sterilize edilir.
Sterilize edilen besiyerleri soğutulduktan sonra bozulmaması için buzdolabında saklanır.
Saklanan besiyerleri ihtiyaç olduğunda su banyosunda eritildikten sonra petrilere dökülür.
Besiyerinin Depolanması :
Dehidre besiyerleri higroskopik (nem çekici) özelliktedir. Dolayısı ile ağzının sıkı bir şekilde kapatılmış olarak kuru yerlerde depolanması gerekir.
Besiyeri kutusu ilk açıldığında üzerine açım tarihi yazılmalı ve hiçbir koşulda aynı besiyeri çeşidinden aynı anda birden fazla kutu açılmamalıdır.
Besiyerleri hazırlandıktan sonra sterilize edilir ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında depolanır. Bazı besiyerlerinin hazırlandığı gün kullanılma zorunluluğu vardır.
Hazırlanmış besiyerlerinde nem kaybından kaçınmak gerekir.
Besiyerleri petri kutusuna döküldükten sonra depolanmak isteniyorsa; kutuların üzerine döküldüğü tarih not edilerek en çok 10 gün içinde kullanılmak üzere buzdolabında depolanabilir.
Petri kutularının mutfak tipi strech film ile sarılarak depolanması raf ömrünü uzatan bir uygulamadır.
Hazırlanmış besiyerleri elden geldiği ölçüde serin ortamlarda tutulmalıdır. Ancak, özellikle agarlı besiyerlerinin dondurulmasından kesinlikle kaçınılması gerekir. Dondurma, agarın jelleşme özelliğine önemli ölçüde zarar verir.
Katkıların Eklenmesi :
Çeşitli antibiyotikler, vitaminler, kan ve yumurta sarısı başta olmak üzere besiyeri bileşimine giren bazı maddeler otoklavlama sırasında tahrip olur ya da yüksek sıcaklıkta bileşimdeki maddeler birbirleri ile reaksiyona girer. Bu gibi maddeler otoklav sonrasında bazal besiyerine ilave edilir.
Katkı ilave edilmiş agarlı besiyeri hızla Petri kutularına dökülmelidir. Aksi halde katkı yüksek sıcaklıktan olumsuz etkilenir ve sahte negatif sonuçlar alınabilir.
Katkıdan steril koşullara uyularak gereken miktarın alınmasından sonra yine steril koşullara uyularak ağzının kapanmasına özen gösterilmelidir.
Aksine bir uyarı yoksa besiyeri katkıları 2–8 oC’da depolanır.
Petri Kutularına Döküm :
Otoklav sonrası agarlı besiyerleri uygun sıcaklığa geldiğinde Petri kutularına dökülerek kullanılır. Ya da buzdolabında saklanan agarlı besiyerleri su banyosunda eritildikten sonra uygun sıcaklığa geldiğinde Petri kutularına dökülerek kullanılır.
Besiyeri dökülmeden önce, homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır.
Besiyerinin yaklaşık 45 oC’a soğutulması ve bu sıcaklıkta Petri kutularına dökülmesi gerekir.
Yüksek sıcaklıklarda dökme, Petri kutusunun kapağı içinde aşırı su yoğunlaşmasına yol açar. #
Eğer Petri kutusunda “dökme plak yöntemi ile kültürel sayım” yapma amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 40 °C’ı geçmemelidir.
Agarlı besiyeri döküldükten sonra kalınlığın “en az 2–3 mm” olması önerilmektedir.
Besiyeri döküldükten sonra Petri kutuları yatay bir zeminde soğumaya ve katılaşmaya bırakılır.
Swap Analizi
Firmalardan uygun koşullarda alınmış swaplardan, daha önceden hazırlanmış olan ikili petrilere geçiş yapılır. Swap analizi ile firmanın isteğine göre; S. aureus – Koliform için Baird Parker Agar – Violet Red Bile Agara S. aureus – Toplam canlı için Baird Parker Agar – Plate Count Agara Toplam canlı – Koliform için Plate Count Agar – Violet Red Bile Agara Küf ve Maya için Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agara geçiş yapılır. Ekim sonunda üzerlerine tarih ve swap numarası yazılmış petriler inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda ise değerlendirilir.
Membran Filtrasyon ile Suda Analiz
Membran filtrasyon sistemi özellikle içme suyu ve berrak meyve suları gibi filtrasyonda sorun çıkarmayan ve çok az sayıda mikroorganizma bulunabilen örnekler için idealdir. Laboratuarda E.coli, Koliform, Enterekok ve toplam canlı analizi için membran filtrasyon kullanılıyor. Analiz yapılacak numune; içerdiği mikroorganizmaların büyüklüğünden daha küçük gözeneğe sahip membran filtre ile vakum yardımıyla süzülür.
Mikroorganizmaların üzerinde kaldığı membran petri kaplarına alınıp inkübe edilir. Analiz yaparken izlenecek yol ;
Hazır besiyeri içeren petriler çıkarılır. Petri kapaklarına gerekli olan bilgiler yazılarak petriler hazır hale getirilir.
3,5 ml ayarlı olan dozaj şırıngasının filtresi bek alevi yanında el değmeden değiştirilir. Ardından kullanılacak olan saf su yine steril olarak değiştirilir.
Çıkarılan hazır besiyerlerine dozaj şırıngası ile 3.5 ml saf su ilave edilir.
Filtre desteği bek alevi yardımıyla sterilize edilir .
Steril paketlerdeki membran filtre alev yanında el değmeden açılır.
Pens alevden geçilip sterilize edildikten sonra membran pens ile alınıp filtre desteğine yerleştirilir.
Isıtılan destekteki membranın koruyucu tabakası pens ile alınır.
Huni alevden geçirilip desteğe yerleştirilir.
Huni kapağı açılarak alev yanında numune 100ml eklenir.
Vakum pompası ile su membrandan geçirilir.
Filtrasyon işleminden sonra vakum kapatılır.
Filtre pens ile alınıp steril su ile ıslatılmış olan besi ortamı üzerine yerleştirilir.
Besiyerleri inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda koloniler sayılıp rapor edilir.
Mikrobiyolojik Analizler
Mikrobiyoloji Laboratuarında Tarım ve Köyişleri Bakanlığı İl Müdürlüğü tarafından gönderilen Türk Gıda Kodeksindeki uygulamalara göre analiz yapılmaktadır.
Öncelikle, laboratuar tarafından analize alınmak üzere numune kabul edilmelidir. Bu kabul için laboratuar personeli, numunenin laboratuara gereken koşullarda getirilip getirilmediğini kontrol eder. Eğer standart koşullarda getirildiğine emin olunursa, numune analiz için kabul edilir. Aksi halde ya numune kabul edilmez ya da kabul formuna bununla ilgili tüm olumsuzluklar yazılır.
Laboratuara gelen ve kabul edilen örnek için, kabul tarihi, kabul saati, ürün ile ilgili tüm bilgiler (üretim tarihi, ambalaj özellikleri, parti numarası, vardiya numarası, numunenin alındığı saat, gerekli ise örnek alım sıcaklığı, laboratuara giriş sıcaklığı vb.) kayda alınır.
Analiz için gelen örnek mümkün olan en kısa süre içinde analize alınmalıdır. Analiz için bir süre beklemek zorunluluğu varsa;
– Mikrobiyolojik olarak stabil olan ürünler son kullanma tarihinden önce ve elden geldiği kadar çabuk olarak analize alınmalıdır.
– Taze ve soğutulmuş ürünler kabulden sonra 24 saat içinde analize alınmalıdır.
– Dondurulmuş ürünler +4 °C buzdolabı sıcaklığında çözündürülmelidir. Dondurulmuş ürün analiz amacıyla çözündürüldü ise analiz ertelenemez.
Laboratuara gelen ve kabul edilen numunenin paraleli analiz bitinceye kadar ürün özellikleri değişmeyecek şekilde şahit olarak korunur.
Ürünlerden belirli bir ağırlığın (10 g, 25 g vb.) tartılarak analiz için numune alınması aseptik koşullar altında yapılır.
Laboratuarda incelenen numuneler raporların işletmeye gönderilip, işletmeden onay gelene kadar soğuk ortamda saklanır.
Yapılan deneylerde kullanılan malzemelerin hata oluşturmasını önlemek için , kullanılan malzemelerden de ekim yapılır.
Seyreltme işlemi bitirildikten sonra hızla ekim yapılır.
Petri kutularının ekime başlamadan önce yazılmış olması işlem sırasında gereksiz beklemelerin ve karışıklıkların önüne geçer.
Ekim yapılan petriler etüvlere ters olarak yerleştirilir. Sadece DRBC ve su analizinde kullanılan petriler etüvlere düz olarak yerleştirilir. Ayrıca DRBC’ler mutfak tipi streç film ile sarılarak etüvlere konmaktadır.
Staphylococcus aureus Analizi :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Staphylococcus aureus analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.
BPA (Baird Parker Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.
Drigalski spatülü yardımıyla numune BPA besiyerine yayılır.
Petriler ters olarak 35 °C de 48 saat inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda Staphylococcus aureus yuvarlak, 1 – 1.5 mm çapında, düzgün kenarlı ,etrafında şeffaf bir zon bulunan siyah koloniler meydana getirir.
Şüpheli bulunan siyah, zonlu kolonilere koagülaz testi yapılır.
Koagülaz (+) özellik gösteren koloniler sayılır.
Bacillus cereus Analizi :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Bacillus cereus analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.
MYP (Mannitol-Egg-yolk-Polymyxine Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.
Drigalski spatülü yardımıyla numune MYP besiyerine yayılır.
Petriler ters olarak 30 oC de 48 saat inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda Bacillus cereus pembe-mor renkli, etrafında opak çerçeve olan basık yüzeyli koloniler meydana getirir.
Bu kolonilerin Bacillus cereus olduğunu doğrulamak için saflaştırma yapılarak biyokimyasal test uygulanır (API Testi).
Clostridium perfringens Analizi :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Clostridium perfringens analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.
TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.
Drigalski spatülü yardımıyla numune TSC besiyerine yayılır.
Daha sonra üzerine uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş TSC dökülür.
Clostridium perfringens anaerobik bir bakteri olduğundan petriler genbag lere konularak 35 oC de 24 saat inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda Clostridium perfringens siyah renkli koloniler meydana getirir.
Bu kolonilerin Clostridium perfringens olduğunu doğrulamak için saflaştırma yapılarak biyokimyasal test uygulanır (API Testi).
Küf – Maya Analizi :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Küf – Maya analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.
DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.
Drigalski spatülü yardımıyla numune DRBC besiyerine yayılır.
Petriler streç film ile sarıldıktan sonra ters çevrilmeden 25 °C de 5 gün inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda küfler ve mayalar ayrı ayrı sayılır.
Sayımlarda 10-150 arasındaki petriler dikkate alınır.
Enterobacteriaceae Analizi :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Enterobacteriaceae analizinde dökme plak yöntemi kullanılır.
Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.
Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.
Petriler 35 °C ‘de 24 saat inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda Enterobacteriaceae pembe renkli koloniler meydana getirir.
Şüpheli bulunan pembe koloniler saflaştır ve oksidaz testi yapılır.
Oksidaze (-) özellik gösteren koloniler sayılır.
Koliform Analizi (kob/g) :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Koliform analizinde dökme plak yöntemi kullanılır.
Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.
Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş VRB (Violet Red Bile Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.
Petriler 35 °C ‘de 24 saat inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda koliform bakteriler; pembe renkli ve zonlu koloniler meydana getirir.
E. coli Analizi (kob/g) :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
E. coli analizinde dökme plak yöntemi kullanılır.
Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.
Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş TBX (Tryptone Bile X glucoronide Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.
Petriler 44 °C ‘de 24 saat inkübasyona bırakılır.
İnkübasyon sonunda bakteriler; yeşil renkli koloniler meydana getirir.
Bu kolonilerin E. coli olduğunu doğrulamak için saflaştırma yapılarak biyokimyasal test uygulanır.
Aerobik Koloni Sayımı 35 °C :
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.
Aerobik koloni sayımında dökme plak yöntemi kullanılır.
Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.
Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş PCA (Plate Count Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.
Petriler 35 °C ‘de 48 saat inkübasyona bırakılır.
Oluşan bütün kolonilerin sayımı yapılır. Koloni sayısı 25-250 arasında ise sayım yapılır; fazla ise sayılamayacak kadar çok olarak değerlendirilir.
MPN Tekniği ile Koliform Bakteri ve E. Coli Analizi
Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.
90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.
Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.
Hazırlana çözeltiden 9 ml LST bulunan durham tüplü üç tüpe ekim yapılır.
9 ml Maximum Recovery Diluent içeren tüpe 1 ml 10-1dilüsyon konularak 10-2 dilusyon elde edilir.
10-2 dilüsyondan 9 ml LST bulunan durham tüplü üç tüpe ekim yapılır.
Aynı işlemlerle 10-3 dilüsyon elde edilir ve 3 tüpe ekim yapılır.
Böylelikle MPN tekniği uygulanmış olur.
Tüpler Koliform tespiti için 37 °C de 48 saat inkübe edilir.
Bu süre sonunda gaz oluşan tüplerden bir öze ile 9 ml Brillant Green Bile Broth bulunan tüplere ekim yapılır.
Tüpler 44oC de 24-48 saat inkübe edilir.
Gaz oluşumu gösteren tüpler (+) olarak değerlendirilir.
Koliform Bakteri :
Pozitif olan LST tüplerinden 10 ml Brillant Green Laktoz Broth (durham tüplü) içeren tüplere öze ile geçiş yapılır .
35 °C de 48 saat inkübe edilir.
Gaz oluşumu gözlenen tüpler (+) olarak değerlendirilir ve EMS tablosuna göre sonuç belirlenir.
Fekal Koliform :
Pozitif olan LST tüplerinden 10 ml EC Broth (durham tüplü) içeren tüplere öze ile geçiş yapılır.
44 °C de 48 saat inkübe edilir.
Gaz oluşumu gözlenen tüpler (+) olarak değerlendirilir ve EMS tablosuna göre sonuç belirlenir.
E.coli :
Fekal Koliform testinde gaz oluşan EC Broth tüplerinden EMB agar petrilerine geçiş yapılır.
35 °C de 24±2 saat inkübe edilir.
Eğer metalik yeşil renkli koloniler oluşmuşsa E. coli kolonilerinden identifikasyon için tek koloni alınarak Nutrient agara geçilerek 35oCde 24±2 saat inkubasyonla zenginleştirme yapılır.
Bu zenginleştirilen kolonilere IMVIC testi uygulanır.
IMVIC testi indol, metil red, voges proskauer, ve cimon citrate testlerinden oluşur.
Hızlandırmak amacıyla son basamak olan cimon citrate yapılır.
Metalik yeşil renkli kolonilerden cimon citrate besiyerine ekim yapılır.
37 °C’ de 24 saat inkube edilir.
Eğer besiyeri rengi maviye dönmüşse koloniler E.coli değildir. Salmonella Analizi :
Steril bir kavanoza 25 gr numune tartılır.
Üzerine 225 ml Buffered pepton ilave edilir . 35 °C ya da 37±1 °C de 18±2 saat inkübe edilir. Bu ön zenginleştirme aşamasıdır.
Bu süre sonunda hazır olarak alınan MKTT tüpüne 1 ml, RVSye de 0,1 ml ilave edilir.
MKTT besiyeri 24 saat 37oC de, RVS 24 saat 41,5oC de inkube edilir. (Selektif sıvı besiyerinde zenginleştirme)
Bu süre sonunda katı besi yerleri olan XLD ve HE agarlara geçilip 37 °C de 24 saat inkube edilir.(Selektif katı besiyerlerinde zenginleştirme)
HE de koloniler siyah merkezli mavi yeşil renkte gözlenir, XLD agarda ise merkezleri siyah pembe olan koloniler gözlenir.
XLD ve HE de üremiş olan koloniler Nuutrient agara tek geçilerek 24 saat 37oC de inkübe edilir.
Zenginleştirilen kolonilerden tek düşen Salmonella spp. İçin tipik koloniden 1 tanesi aseptik koşullarda alınarak api 20 E hazır biyokimyasal test kitine de geçilebilir.
18-24 saat inkübe edilir . Sonuç bilgisayar ortamında değerlendirilir.
Salmonella (Hızlı Test) Analizi :
Steril bir kavanoza 25 gr numune tartılır.
Üzerine 225 ml pepton ilave edilir. 37oC de 18 inkübe edilir. Bu ön zenginleştirme aşamasıdır.
Bu süre sonunda rapid test kiti hazırlanır.(Oxoid)
Bu kitte A ve B diye adlandırılan iki tüp bulunmaktadır. Dış kabın üzerinde üç farklı çizgi bulunmaktadır.
Birinci çizgiye kadar saf su ilave edilir.
Tüp içinden üçüncü çizgiye kadar su çekilir. Vortekste karıştırılıp 5 dk beklenir.
İkinci çizgiye kadar Rapid Elective Medium solusyon ve novobiocin diski eklenir.
Hazırlanan kite 1’er ml numune konur.
Tüplerin kapakları açılıp 44±1 °C de 24 saat inkübasyona bırakılır.
A tüpünde siyahlaşma oluşması pozitif, B tüpünde siyah ya da kırmızı renk oluşması sonucun pozitif olduğunu gösterir.
Listeria monocytogenes Analizi :
Süt ve süt ürünlerinde 25 gr alınarak 225 ml BLEB ile homojenize edilir.
4 saat 30 °C de inkübasyona bırakılır.
0,9 ml supplement eklenir ve zenginleştirme yapılır.
30 °C de 44 saat inkübasyona bırakılır.
Oxford ve Palcam agarlara öze ile ekim yapılır.
35 °C de 24 -48 saat, petriler inkübasyona bırakılır.
Oxford agarda etrafında kahverengi veya siyah zon bulunan ortası çukur koloniler şüphelidir.
Palcam agarda yeşil veya siyah renkli etrafında zon bulunan koloniler şüphelidir.
Bunlar TSAYE besiyerine geçilip 24 saat sonra biyokimyasal teste tabi tutulur.
E.coli O157:H7 Analizi :
Gıda numunesinden 25 g alınarak 225 ml (10-1) cefixime (0,05 mg /l.), cefsulidin (10 mg/l.) ve vancomycin (8mg/l.) içeren % 1 ‘lik Buffered Peptone Water ile homojenize edilerek 37oC de 24 saat inkübe edilir.
İnkübasyon sonrası CT_SMAC besiyerine ekim yapılır.
37°C de 24 saat inkübe edilir.
CT-SMAC Agar’da E.coli O157:H7 suşları sorbitolu fermente etmez ve renksiz koloni oluştururken diğer E.coli suşları sorbitolu fermente etmez ve renkli koloniler oluştururlar.
Sonrasında koagülaz test uygulanır.
Rope sporu Analizi :
11 gr numune alınarak 99 ml distile su eklenir.
5 dk’ da bir çalkalanarak 20 dk kaynar su banyosunda bekletilir.
1 ml alınıp steril ringer çözeltisine aktarılır.
DTB besiyerine üçlü tüp yöntemi ile 1 ml ekim yapılır.
32°C’ de 72 saat inkübasyona bırakılır.
MNP tablosuna göre değerlendirilir.
KİMYASAL ANALİZ LABORATUARI
Yapılan bazı analizler :
Toplam Aflatoksin Analizi :
Bebek Ve Çocuk Ek Besinlerinde ;
1. Analiz numunesi iyice homojenize edildikten sonra, 500 ml’lik bir erlene 50 g numune tartılırve 5 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 250 ml metanol:su (80:20) çözeltisinden ilave edilir. Erlenin kapağı kapatılır ve önce elle hızlı bir şekilde 15-30 sn çalkalanır sonra karıştırıcıda 3 dk karıştırılır.
2. Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 20 ml başka bir kaba alınır, üzerine 20 ml saf su veya PBS ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyretilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 20 ml’ si (20 ml 2 g numuneye eş değerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1- 2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.
3. Daha sonra immunafinite kolonu 10ml’ lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.
4. Daha sonra kolondan 1 damla/sn hızla 1ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır. Kolondan 1 damla/sn hızla 1ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
5. Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir ml’ si 1 g numuneye eşdeğerdir.
Baharatlar, Kurutulmuş Otlar Ve Bitkisel Çaylarda ;
1. Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 10 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 200 ml metanol:su (80:20) veya bitkisel çaylar için ise 200 ml asetonitril-su (60:40) çözeltisinden ilave edilir. Blenderin kapağı kapatılır ve yüksek devirde 3 dk karıştırılır.
2. Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 5ml başka bir kaba alınır, üzerine 20 ml %10’luk Tween 20 çözeltisinden ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 10 ml’si (10 ml 0,5 g numunete eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.
3. Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’ lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.
4. Daha sonra kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti bir vialde toplanır. Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
5. Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir milimetresi 0,25 g numuneye eşdeğerdir.
Kuruyemiş – Yağlı Tohum ;
1. Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 10 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 250 ml metanol:su (70:30) çözeltisinden ilave edilir. Blenderın kapağı kapatılır ve yüksek devirde 3 dk karıştırılır.
2. Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 15 ml başka bir kaba alınır, üzerine 30 ml saf su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrat filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 30 ml’si (30ml; 2 g numuneye eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.
3. Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır,saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır. 4. Daha sonra kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
Tahıllar Ve Tahıl Ürünlerinde ;
1. Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 5 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 100 ml metanol:su (80:20) çözeltisinden ilave edilir. Blenderın kapağı kapatılır ve yüksek devirde 1 dk karıştırılır.
2. Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 10 ml başka bir kaba alınır, üzerine 40 ml saf su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 10 ml’si (10 ml ; 1g numuneye eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.
3. Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.
4. Daha sonra kolondan1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
5. Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
6. Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir milimetresi 1 g numuneye eşdeğerdir.
Kırmızıbiber ve Ürünlerinde ;
1. Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 10 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 200 ml metanol: su (80: 20) çözeltisinden ilave edilir. Blenderın kapağı kapatılır ve yüksek devirde 1 dk karıştırılır.
2. Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 10 ml başka bir kaba alınır, üzerine 40 ml saf su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 10 ml’si (10 ml ; 0,5g numuneye eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.
3. Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.
4. Daha sonra kolondan1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
5. Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
6. Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir milimetresi 1 g numuneye eşdeğerdir.
Okratoksin Analizi :
Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 10 g numune tartılır.
Üzerine %1 lik sodyum bikarbonattan 200 ml ilave edilir.
Blenderda yüksek devirde 3 dk karıştırılır.
Blenderdaki içerik santrifüj tüplerine aktarılıp santrifüjlenir ve ardından erlene süzülür.
Kolondan geçirmek üzere PBS hazırlanır. 100’lük balon jojeye fosfat buffered solue tabletten 1 adet atılır ve üzeri UP ile tamamlanır. Balık atıp magnetik karıştırıcı ile karıştırılır.
Filtreden geçirilmiş süzüntünün 20 ml’si, 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla kolondan geçirilir.
Daha sonra hazırlanan PBS’ den 20 ml, 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde kolondan geçirilir. Kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.
Daha sonra kolondan1 damla/sn hızla 1,5 ml MeOH : asetik asit (98:2) geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.
Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır. Kolondan geçirilirken karışması önemlidir. Bu yüzden şırınga ile içine hava verilip çekilerek geçirilir.
Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir.
Boya Analizi :
5 gr numune erlene tartılır.
Üzerine 50 ml UP (ultrapure) eklenir.
İçine balık atarak magnetik karıştırıcıda karıştırılır.
Filtreden geçirilir. ve süzüntü erlende toplanır.
Kolondan geçirilmek üzere propanol, % 1’lik asetik asit ve % 70’lik etanol ayı ayrı beherlere konulup üzerleri uçmayı engellemek için saat camıyla kapatılır.
Kolonu şartlamak için 5 ml prapanol enjektöre alınarak kolondan geçirilir.
Ardından 5 ml asetik asit başka bir enjektörle alınarak kolondan geçirilir.
Böylece kolon şartlaması gerçekleşmiş olur.
Şartlanmış kolondan 10 ml numune süzüntüsü geçirilir.
Doğal boyayı atmak için 5 ml propanol kolondan geçirilir.
Suni boyayı atmak için 5 ml etanolü kolondan geçirilir ve süzüntüsü bir tüpte toplanır.
En son aşamada tüpte toplanan süzüntüden 1 ml alınır ve 10 ml saf su ile seyreltirilir.
Spektroskopi cihazına verip analiz tamamlanır.
Sorbik Asit / Benzoik Asit Analizi :
5 gr numune tartılır.
Numune 100’lük balon jojeye koyulup üzerine 30 ml ultra saf su (UP) eklenir.
Sonra metenolle tamamlanıp karıştır.
Karışım süzülür ve enjektör ile filtreden geçirilip viale toplanır.
Vial cihaza verilir.
Protein Tayini :
Homojen hala getirilen numuneden 0,3 g tartılır.
Üzerine 25 ml sülfrik asit ve 1 adet kheldaki tableti ilave edilir.
Yakma ünitesine koyu yeşil sıvı elde edilinceye kadar yerleştirilip yakılır. Yakma ünitesinin sıcaklığı 420 oC civarındadır.
İstenilen renk elde edilince soğumaya alınır.
Geri soğutucusu açık olan protein cihazında %32’lık sodyum hidroksit ve saf su ile karışarak, geri soğutucuya çarpar ve %4’lük 50 ml barik asitin içeren erlene damlar.
Erlendeki birikinti üzerine 1-2 damla brom kresool red indikatör ilave edilir.
0.1N’lik HCL ile titre edilir.
Sarfiyat miktarı formülde yerine konularak protein yüzdesi hesaplanmış olur.
Aynı işlemler numunesiz olarak gerçekleştirilerek kör hazırlanır ve körün titrasyondaki sarfiyatı bulunur.
Sabit değer ; – Bakliyat ürünleri için 5,80 – Et ve et ürünleri için 6,25 – Süt ve süt ürünleri için 6,38
