Bu metot kahvede HPLC yöntemi ile kafein miktarının tespitini kapsar.
2.0 PRENSİP
Magnezyum oksitli ortamda 90˚C sıcaklıktaki su ile deney numunesinden kafeinin ekstraksiyonu, süzülmesi ve bir UV dedektörün kullanıldığı HPLC tekniği ile kafeinin tayini esasına dayanır.
3.0 ALET VE EKİPMANLAR
– HPLC, UV dedektörlü
– HPLC için kromotografik kolon ( C18 )
– Saflaştırma kolonu ; ters faz için ( en fazla on işlem kullanılabilir )
– Taşıyıcı faz ; metanol/ su karışımı ; 30/70 hacmen
– Etanol/su karışımı ¼ ( v/v )
– Magnezyum oksit
– Stok kafein çözeltisi; 0,500g kafein / L ( etanol / su karışımı ile hazırlanır ) Bu çözelti buzdolabında en fazla bir ay muhafaza edilebilir.
– Standart kafein çözeltileri; standart kafein çözeltileri A ve B kullanılacağı gün hazırlanmalıdır.
– Standart kafein çözeltisi A ; 0,010g kafein / L ( stok kafein çözeltisinden 2,0 ml alınıp su ile 100 ml’ye seyreltilir. ) Kafeini alınmış mamuller için kullanılmalıdır.
– Standart kafein çözeltisi B ; 0,050 g kafein /L ( stok kafein çözeltisinden 10 ml alınıp su ile 100 ml’ye seyreltilir. ) Kafein içeren mamuller için kullanılmalıdır.
5.0 UYGULAMA
5.1. Numune hazırlama ve kafeinin ekstraksiyonu :
· Gerekiyorsa numune öğütülür. Normal, kafeinsiz yeşil veya kavrulmuş kahve numunesinden 0,0001 hassasiyetle 1 g. normal ve kafeinsiz çözünebilir kahve için 0,5 g. numune 250 ml’lik şişeye tartılır.
· Şişedeki kahveye 4g + 0,5 g magnezyum oksit ve 100 g su ilave edilir. Kapağı kapatılır ve 0,1 g hassasiyetle tartılır.
· Şişe içindekiler karıştırılır. Kapağı kapalı bir şekilde 90˚C’deki su banyosunda 20 dk. sürekli çalkalanarak ısıtılır.
· Şişe su banyosundan çıkarıldıktan sonra soğutulur, kurulanır ve 0,1 g hassasiyetle tartılır. Soğutulmuş ve kurulanmış şişenin ağırlığı önceki tartıma eşit olmalıdır.
· İçindekilerin dibe çökmesi için bekletilir, kapağı açılır ve solüsyondan bir kısım 0,45 μm’lik filtreden süzülür.
· Solüsyonda bir ayrım gözlenmeden saflaştırma kolonu aktifleştirilir. ( Musluğunu aç, ve kolonu damla damla akacak şekilde 5 ml metanolle yıka. Silikanın üzerinde 1-2 mm metanol kalınca musluğu kapat. 5 ml su ilave et ve aynı metanoldeki gibi işlem yap. Kolonun kurumasına izin verme, aksi taktirde hazırlık tekrarlanmalıdır. )
· Kolona, normal veya çözünebilir kahve için çöktürmeden önceki aşamadan 2 ml, kafeinsiz kahve için çöktürmeden sonra 10,0 ml kolona koy. Musluğu damla damla akacak şekilde ayarla. Solüsyon silika yüzeyi seviyesine düşünce musluğu kapat.
· Musluğu aç, 2,5 ml amonyak/metanol karışımından ilave et. Silika seviyesine düşünce musluğu kapat. Tekrar 2,5 ml aynı karışımdan ilave et ve tamamen akıt. Yaklaşık 20 ml hava geçir. ( bu aşamada kolon kuruyabilir )
· Kolonun altına 10 ml’ lik balon yerleştir. Damla damla geçecek şekilde musluğu aç ve 7,5 ml yıkama çözeltisi ilave et ve hepsini kolondan geçir. Balonu su ile çizgisine kadar tamamla.
5.2. HPLC çalışma şartları :
· Kolon : C18
· Enjeksiyon miktarı : 10 μm
· Taşıyıcı faz akış hızı : 0,5-1,5 ml / dk
· Kolon sıcaklığı : 40˚C ( şartların optimize edilmesi durumunda 60˚C’ aşmamak gerekir )
· Dalga boyu : 280 nm
6.0 HESAPLAMA
Kafeinli kahveler için :
% Kafein içeriği ( m/m ) = Ax/ AC x c1x ( 10×100) / (2xm0x1000)x ( 100/RS ) x 100
Burada ;
Ax = Deney çözeltisinin verdiği kafein pikinin alanı
Ac = Standart kafein çözeltisinin verdiği kafein pikinin alanı
C1 = Standart kafein çözeltisinin konsantrasyonu g / L
M0 = Deney için kullanılan numunenin kütlesi
RS = Deney numunesinin kuru madde içeriği
Kafeinsiz kahveler için :
% Kafein içeriği ( m/m ) = Ax/ AC x c2x ( 10×100 ) / (10xm0x1000)x ( 100/RS ) x 100
Burada ;
C2 = Standart kafein çözeltisinin konsantrasyonu g / L
