Kâğıt Disk Agar Diffüzyon Yöntemi

Disk diffüzyon yöntemi, hızlı üreyen aerob ve fakültatifanaerob bakteriler icin önerilen kolay, pratik, standartlara uygun yapılırsa halen dünyada rutin laboratuvarlar icin tercih edilen bir testtir. Bu test ile antibiyotiğin veya ekstraktıninhibisyon etkisi kalitatif olarak ölçülür.

Katılaşan agar üzerine antimikrobiyal madde emdirilmiş diskler hafifçe bastırılarak aralarında 2 cm kalacak şekilde yerleştirilir. Bu şekilde hazırlanan petri kutuları bakteri türüne göre belli sıcaklıklarda genelde 37±0.1°C’de 24 saat inkübe edilir. Süre sonunda besiyeri üzerinde oluşan inhibisyonzonları milimetre olarak değerlendirilir.

Disk etrafında inhibisyonun görülmemesi, bakterinin o antibakteriyele karşı dirençli olduğunu veya kullanılan ekstraktınantibakteriyel etkisinin olmadığını gösterir. Çalışmalar 3 paralel olarak yürütülür. Standart antibiyotik diskleri, karşılaştırma yapmak amacıyla kontrol diskleri olarak kullanılır.

a.Koloni Seçimi

Kültürden koloni seçimi
b. İnokulum Süspansiyonunun Hazırlanması

Bakteri kolonilerinin alındığı eküvyon, içinde Mueller-HintonBroth veya Tryptone Soya Brothbesiyeri bulunan 5 ml’lik tüpün dibine daldırılır, karıştırılır ve kolonilerin besiyerine iyice süspanse olması sağlanır. Eküvyon, kullanılmışsa tüpün iç yüzeyine bastırılarak çıkarılır.
c. Agarlı Petrilere İnokulum Yapılması

Steril bir eküvyon süspansiyonun içerisine daldırılır, karıştırılır. Eküvyon tüpün iç kenarına bastırılarak çıkarılır. Agarın bir tarafından başlanarak tüm yüzeye yayılır

Süspansiyonunun eküvyonla yayılması
d. Antimikrobiyal Disklerin Yerleştirilmesi

Antimikrobiyal diskler oda ısısına getirilir. Aynı gruptaki antibiyotiklerin etki mekanizmaları aynıdır. Mümkün olduğu kadar çok sayıda farklı grup antibiyotik diski ile test yapılır.

e. Mueller-Hinton Besiyerinin İnkubasyonu

35° C’de 18 – 24 saat inkübe edilir. Aerob olanlar, oksijenli ortamda, anaerob olanlar ise jarda sağlanan oksijensiz ortamda etüvde üretilir. Jarda yapıldığı takdirde, 90-100 mm çaplı petriler tercih edilmelidir.
f. İnhibisyon Zonlarının Değerlendirilmesi

Antibiyotik etkili ise üremenin engellendiği bir inhibisyonzonu oluşur. Siyah bir zemin üzerinde diskler de dâhil olmak üzere inhibisyonzon çapları milimetrik cetvelle ölçülür.
İnhibisyonzon çaplarının milimetrik cetvelle ölçümü
g. Test Sonuçlarının Değerlendirilmesi

Antibiyotik duyarlılık testlerinin sonuçlarının tekrarlanabilir olması, yani aynı koşullarda tekrarlandığında, sonuçların aynı veya birbirine yakın olması gerekir. Testlerin uygun şartlarda yapılıp yapılmadığı, kalite kontrol suşları ile (referans suşlar) denetlenir. Bu suşlarla beklenen sonuçlar elde edilemezse antibiyotik duyarlılık testlerinin tekrarlanması gerekir.

inhibisyonzon görünümleri

KAYNAKLAR:

[1] Temiz A., 2004. Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri. Ankara.

[2] Anonymous, 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları, Ed: A. K. Halkman, Ankara.

[3] T.C. Millî Eğitim Bakanlığı (Mesleki Eğitim ve Öğretim Sisteminin GüçlendirilmesiProjesi) Gıda Teknolojisi Mikrobiyolojik Numune Hazırlama, Ankara, 2007.

[4] www.mikrobiyoloji.org, 2008-2009.

[5] Sert S., Özdemir S., 2001. Gıda Mikrobiyolojisi Uygulama Notları., Erzurum.

[6] Sezgin N., 2002. Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Baran Ofset, Ankara.

[7] Toroğlu S., Çenet M., 2006. Tedavi Amaçlı Kullanılan Bazı Bitkilerin Kullanım Alanları ve Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Metodlar, KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9 (2).
[8] Toğay S.Ö., Bağcı U., Şener A. Enterobacter sakazakii ve Gıda Endüstrisindeki Önemi, Hacettepe Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Beytepe, Ankara.

[9] Lovett, J., (1988),Isolation and enumeration of Listeria monocytogenes. FoodTechnol42:172.

[10] Hayes, PS.,Graves, LM., Ajello, GW., Swaminathan, B., Weaver, RE., Wenger, JD., Schuchat, A., Broome, CV., (1991), Comparison of coldenrichmentand U.S. Department of Agriculture methods for isolating Listeria monocytogenes from naturally contaminated foods. Appl. Environ. Microbiol. 57:2109.

…