Genel Bilgi: Birkaç modifikasyonu olmakla beraber Gram boyama yönteminde temel ilke Olarak, tesbit edilmiş preparatın üzerine kristal viyole boyası ve gram iyot eriyiği (lugol) uygulandıktan sonra %95’lik etil alkol ile renksizleştirme işlemi yapılır ve sonra zıt bir boya eriyiği ile (sulu fuksin veya safranın gibi) uygulanarak yöntem tamamlanır. Bakterilerin büyük bir çoğunluğu bu boyama ile gram (+) veya gram (-) olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Gram boyama yönteminde önce uygulanan kristal viyole ve mordan olarak kullanılan iyot eriyiğinin uygulanmasından sonra preparattaki boyanabilir tüm bakteriler boyayı alırlar. Mordanlar boyaların nüfuz kabiliyetini artırır ve daha iyi boyanmalarını sağlarlar. Alkol ile yapılan renksizleştirme işleminde gram (+) bakterilere aldıkları boyayı bırakmazlar. Gram (-)’ler ise boyayı bırakarak renksizleşirler. Bunlarda son uygulanan zıt boya (sulu fuksin vs.) ile boyanırlar. Bu suretle gram (+) bakteriler mor, gram (-)’ler zıt boya renginde (sulu fuksin ile pembe-kırmızı) boyalı olarak görünürler. Bazı bakteriler gram (+) oldukları halde eskiyen kültürlerinde gram (-) varyantlar oluştururlar. Bazıları ise gram (+) oldukları halde alkolün biraz fazlaca uygulanması ile boyalarını bırakabilirler. Bunlara gram değişken bakteriler denir. Gram (+) mekanizması olayının bakterilerin hücre çeperi yapısına bağlı olduğu bilinmektedir. Gram (+) bakterilerin hücre duvarları gram (-)’ den farklıdır. Bunlardaki peptidoglikan katmanı daha kalındır. Bu şekilde tüm hücre çeperinin %50’si peptidoglikandan ibarettir. Ayrıca çoğunda gram (-)’lerde bulunmayan teikoik asit bulunur. Gram (-)’lerin hücre duvarında ise farklı olarak bir lipopolissakkarit katmanı vardır. Bunlarda peptidoglikan yapı incedir. Her iki grup bakteride kristal moru ve lugolun hücre duvarını geçerek hücrenin içine girdikleri, gram (+)’larda bu boyaların hücre çeperi ile zor ayrılabilen bileşikler yaptığı bilinmektedir. Kristal Viyoletin Hazırlanması : Kristal viyolet 1g. Asit – Fenik kristali (fenol kristali) 2 g. Etil alkol (% 96) 10 mL. Distile su 100 mL. Kristal viyolet ve fenol kristali porselen havanda ezilir ve etil alkol yavaşça eklenir.

Lugol solusyonunun hazırlanması: Gram boyama yönteminde mordan olarak kullanılır. İyot 1 g. veya İyot 5 g. KI 2 g. veya KI 10 g. Distile su 300 cc. veya Distile su 100 cc. İyot ile KI havanda iyice ezilir. Sonra distile su yavaş yavaş katılır ve iyice karıştırılır. Sonra şişeye aktarılır. Kahverengi şişelerde saklanır. Bazik Fuksin (Stok Solüsyon) Bazik Fuksin 10 g %95 lik Etil alkol 100 ml Bazik fuksin havanda ezilir ve alkolle eritilir, 370 °C’de bir gece bekletildikten sonra filtre kağıdında süzülür ve cam kapaklı şişelerde saklanır. Sulu Fuksin Solüsyonu Bazik fuksin (stok) 10 ml Distile su 100 ml Fuksin distile suda iyice karıştırılır ve filtre kağıdında süzülür. (Tıbbi Laboratuvar Mikrobiyolojik Preparat Hazırlama, MEB,Ankara, 2011) Deneyin Yapılışı: 1) Sıvı ve katı kültür ortamından öze ile alınıp lam üzerine yayılan bakteri kültürünün havada kuruması sağlanır. 3 defa alevden geçirilerek fiziksel tesbit yapılır. 2) Lam ( préparât ) boya kabına konarak, kristal viyole ile 1 dakika boyanır. 3) 1 dakika sonra kristal viyole boya kabına dökülür. 4) Lam üzerinde kalan boya üzerine lugol ilavesi yapılır. 1 dakika beklenir. 5) 1 dakika sonra boya kaba dökülerek, % 95′ lik Etil Alkol ve su ile boya akmayıncaya kadar yıkama İşlemi yapılır. 6) Bu işlemden sonra lam üzerine (preparat) safranin dökülerek 15-20 saniye dakika beklenir. Boya dökülüp, lam yıkanarak kurulanır. Bir damla immersiyon yağı damlatılarak mikroskopla

incelenir ( 100 x ). Objektif sahasında görülen mor renkli bakteriler Gram (+), pembe renkli olanlar ise Gram ( – ) olarak adlandırılır. Gram boyama değerlendirme çizelgesi İşlem Yöntem Sonuç Gram (+) Gram (-) İlk boya Kristal viole ile 1-2 dk Mor renk Mor renk Lugol (mordan) Lugol ile 1 dk Mor renk Mor renk Renk giderme %95’lik alkol ile 20-30 sn Mor renk Renksiz Zıt boyama Sulu fuksin ile 20-30 sn Mor renk Pembe renk (sulu fuksinin rengi) Sonuç; gram (+)’ler ilk boya olan kristal violenin rengi olan mor renk, gram(-)’ler zıt boya olan sulu fuksinin rengi pembe renge boyanır.

…