Enterobacter Sakazakii ve Riskli Gıdalar

Enterobacter sakazakii, Enterobacteriaceae familyasında yer alan, hareketli, Gram-negatif, katalaz +, çubuk sekilli bakteridir. İlk başlarda Enterobactercloacae’nın sarı pigment olusturan bir varyantı oldugu düşünülse de 1980’de Enterobacter sakazakii ileEnterobacter cloacae arasındaki DNA-DNA hibridizasyon, biyokimyasal reaksiyonlar, sarı pigment oluşturan koloniler ve antibiyotik duyarlılığındaki farklılıklardan dolayı Enterobacter sakazakii yeni bir tür olarak tanımlanmıştır (Japon mikrobiyolog Riichi Sakazaki’nin adı verilerek). 2007 yılından itibaren Cronobacter sakazakii adını almıştır.

E. sakazakii enfeksiyonlarının özellikle toz bebek mamalarından kaynaklandığı ifade edilmektedir. Bu bakteri bebek mamalarının dışında; peynir, et, sebze, hububat, bitki ve baharatlar vb gıdalardan da izole edilmektedir. Enterobacter sakazakii’nin toz bebek maması üretiminin pastörizasyon prosesinde canlı kalamadığı ancak bu ürünün pastörizasyonu takiben yapılan mikronutrientlerin eklenmesi ve rekonstitüsyon işlemleri sırasında kontamine olduğu belirtilmektedir. E. sakazakii’nin, klinik ve gıda izolatları için minimum üreme sıcaklığının 5.5-8.0°C arasında gözlendiği ve ortalama jenerasyon süresinin de 23°C’de 40 dakika, 10°C’de ise 4.98 saat olduğu belirlenmiştir. E. sakazakii suşlarının 4°C’de üremediği ve bu sıcaklıkta depolama süresi boyunca canlılıklarını kaybettikleri ifade edilmiştir.

Yapılan bir çalışmada ise bakterinin bebek mamalarında 6°C gibi düşük bir sıcaklıkta üreyebildiği, optimum üreme sıcaklığının ise 37-43 °C olduğu belirtilmektedir. Bakterinin lateks, polikarbonat, silikon ve paslanmaz çelikte tutunabildiği ve gelişebildiği belirtilmektedir. E. sakazakii’nin neden olduğu nekrotik enterokolitis ve menenjitis vakaları, etkenin bebek mamalarına ve beslenmede kullanılan malzemelere kontaminasyonundan dolayı yenidoğan bakım ünitesinde sıkça görülmektedir. Ayrıca E. sakazakii’nin viskoz kapsül materyali oluşturduğu ve bu nedenle de besleme ekipmanları ve temas yüzeylerinde biyofilm oluşturabildiği belirtilmektedir.

Tanımlama Yöntemleri

Birçok farklı tanılama yöntemi vardır. FDA tarafından önerilen E. sakazakii belirleme yönteminde tamponlanmış peptonlu su içinde bir ön zenginleştirme yapılmakta. Bunu takiben de Enterobacteriaceae Enrichment Broth’da zenginleştirme işlemi yapılmakta ve Violet Red Bile Glucose Agara (VRBGA) yapılan ekimler sonucunda gelişen şüpheli kolonilerden 5 adet koloni Tryptone Soy Agar (TSA) besiyerine alınarak 25°C’de 48-72 saat inkübe edilmektedir. TSA besiyerinde gelişen tipik sarı pigmentli koloniler API 20 E biyokimyasal test kiti ile doğrulanmaktadır. E. sakazakii’ nin hızlı tanımlanmasında ayrıca a-glukosidaz temelli PCR ve rRNA hedefli moleküler biyolojik tekniklerden de yararlanılabilmektedir.

Ancak E. sakazakii’nin izolasyon ve tanımlanmasında basitleştirimiş yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. E. sakazakii’nin biyokimyasal özelliklerinden yola çıkılarak bazı kromojenik besiyerleri geliştirilmiştir.

E. sakazakii analizinde kullanılan kromojenik agarlar:

Üretici Firma	Besiyeri Adı	E. sakazakii kolonileri
AES	ESIA®Agar	Mavi koloniler
Biokar Diagnostics	COMPASS E. Sakazakii Agar	Mavi-yeşil koloniler
Biomerieux	Chrom IDTMSakazakii Agar	Mavi-gri’den mavi siyaha kadar değişen renklerdeki koloniler. Nadiren yeşil-siyah koloniler
LAB M	HarlequinTM Cronobacter sakazakiiIsolation Medium (CSIM)	Mavi-yeşil koloniler
Merck	ChromoCult® E. Sakazakii Agar	Turkuaz renkli koloniler
Oxoid	Chromogenic E. Sakazakii Agar (DFI formülasyonu)	Mavi yeşil koloniler
R&F Laboratories	R&F® E. Sakazakii Chromogenic Plating Medium	Zonlu veya Zonsuz mavi-siyah ve mavi-gri koloniler
Sigma-Aldrich	HiCromeTM E. Sakazakii Agar	Mavi-yeşil koloniler

E. sakazakii’nin, Enterobacter Sakazakii Agarda görünüşü:

Süt ve Süt Ürünlerinde Enterobacter sakazakii’ nin belirlenmesi konulu standartta (2006) bildirilen ISO yöntemi ön zenginleştirme ve zenginleştirme işlemleri ile izolasyonda kullanılan kromojenik boya içeren selektif katı besiyeri ve inkübasyon sıcaklık dereceleri bakımından FDA’ nın yönteminden oldukça farklıdır.

Tablo 2. 3. Cronobacter sakazakii İzolasyon ve İdentifikasyonunda ISO Yöntemi

GÜN	SAFHALAR
0	50g numune 450 ml steril TPS içinde çözündürülür ve 37 ˚C’ de 18 saat ön zenginleştirme için inkübe edilir.
1	Ön zenginleştirme yapılan örnekten 0,1 ml 10 ml modifiye LST (0,1 ml vancomycin içerir) bulunan tüplere alınır ve 44 ˚C’ de 24 saat inkübe edilir.
2	Zenginleştirme örneklerinden bir öze dolusu (0,1µl) ESIA üzerine öze ile ekilir ve 44˚C’ de 24 saat inkübe edilir.
3	Beş Cronobacter sakazakii şüpheli koloni TSA’ ya geçilir ve 25˚C’ de 48 saat inkübe edilir.

Günümüzde identifikasyon için ise biyokimsayal testler yerine daha az analiz süresi ve iş yükü sağlayan hızlı test kitleri kullanılarak tanımlama (API 20E ve API 32E) ve moleküler yöntemler önem kazanmıştır.

E. sakazakii’nin, TSA’da görünüşü:

KOH Testiyle Gr (-) ve Gr (+) Bakterilerin Ayrılması:

Gr boyama metodu çok daha güvenilir olmakla birlikte, bu test kabaca yapılan genel durum tespit çalışmalarında hızlı bir yöntem olarak yeterlidir.

Prensibi ve uygulanışı: Temiz bir lam üzerine bir veya birçok koloni konulur. Üzerine 1-2 damla %3’lük potayum hidroksit çözeltisi (KOH) damlatılır ve  öze yardımı ile bastırılarak karıştırılır. Yaklaşık 5-10 saniye sonra öze dikkatli bir şekilde damla üzerinden kaldırılır. Mukoza benzeri (çekince uzayan) bir oluşum veya ipliklenme görülürse, bakterinin Gr(-) olduğu düşünülür.

Mukoza benzeri oluşum, bakteri hücre çeperlerinin yıkımı ve bunun sonucu olarak DNA’nın açığa çıkmasıyla açıklanabilmektedir.

Katalaz Testi:

A:Kontrol edilecek sıvı kültüre %3’lük H₂O₂ çözeltisinden damlatılır.

B: Koloni öze yardımı ile lam üzerine konur ve üzerine %3’lük H2O2 çözeltisinden damlatılır.

C. Katı besiyerinde gelişen koloni üzerine %3’lük H₂O₂ çözeltisinden damlatılır.

Tüpte, petride veya lam üzerinde gaz kabarcıkları oluşumu katalaz pozitif olarak değerlendirilir.

…