Enstrümental Gıda Analizleri Ders Notları ( Gümüşhane Üniversitesi )

1. ENSTRÜMENTAL GIDA ANALİZLERİ Yrd. Doç. Dr. Cemalettin BALTACI Doç. Dr. Ali GÜNDOĞDU 2012

GENEL BİLGİLER Bir gıda numunesinde kimyasal bir analizin sonuçlandırılması maddenin bir fiziksel özelliğinin ölçülmesiyle olur. Ölçülen özellikler başlıca; kütle, basınç, yoğunluk, optik, özellikler, radyasyon kapasitesi, potansiyel ve iletkenlik olarak belirlenebilir. Analitik kimya, maddelerin kimyasal bileşimlerini ve bileşenlerin miktarlarının belirlenmesi için yöntem ve alet geliştirilmesini amaçlar. Geniş anlamda bir kimyasal analiz cihazı, doğrudan doğruya saptanamayan bir sinyali kişilerin anlayabileceği bir şekle dönüştürerek veren bir enstrümandır. Yani bir cihaz, incelenen sistem ile kişi arasındaki iletişimi sağlayan bir aracıdır. Enstrümantal analizin gelişmesi elektronik bilgisinin ilerlemesiyle paralellik gösterir; çünkü bir sinyalin üretilmesi, yükseltilmesi ve görüntülenmesinin hızla gerçekleştirilmesi ancak elektronik çevrimlerle mümkündür. Kimyasal sinyalleri elektrik sinyallerine çeviren çok sayıda transduserler vardır; keza elde edilen elektrik sinyallerini yükselten amplifikatör çeşitleri de çok fazladır. Modern analizci bir analiz cihazının en yüksek verimle kullanılabilmesi için ne derecede elektronik bilgiye gereksinimi olduğu sorusu ile karşı karşıyadır. Görünen şudur ki analizcinin elektronik devrelerin çalışması hakkında kalitatif düzeyde bir bilgiye sahip olması istenir. 1.1 Nitel (qualitative)(kalitatif) analiz; karışımda neler olduğunu anlamak için yapılan analizdir. 1.2 Nicel (quantitative)(kantitatif) analiz, bir karışım içerisindeki maddelerin miktarlarını ölçmek için yapılan analizdir. Genelde bu iki kavram, benzer kelimelerle ifade edildiği için kolaylıkla karıştırılabilir. Nitel analizde, maddelerin niteliği yani ne kadar içerdiği bakılırken, nicel analizde, maddelerin niceliği yani ne oldukları incelenir gibi bir mantık yürütmek sanırım bu karışıklığı engeller. Nicel analiz yöntemleri olarak; gravimetrik, volumetrik, spektroskopik yöntemler (atomik soğurma, Fluorometri, UV-VIS vs. ), kromatografik yöntemler, refraktometri ve ismini simdi sayamayacağım birçokları söylenebilir. Nitel analiz yöntemleri olarak da, katyon ve anyon analizleri, TLC (hoş aslında nicel analiz olarak sayılır ama nicelden çok nitel amaçlı kullanılır), kütle spektroskopisi gösterilebilir. Bir de bu iki analiz türünün birlikte kullanıldığı yöntemler vardır ki en kralı bunlardır. GC-MS (Gaz kromatografisi üstüne kütle spektroskopisi) karışımı önce ayırıp neyden ne kadar olduğunu bulup sonradan da bu ayrılanların ne olduğunu anlamamız için kütle spektroskopisine bakar ki oldukça kullanışlı bir analiz yoludur. 1.3 Kimyasal Analiz a- Numune alma, b-Ayırma, c- Yöntem Seçimi, d- Ölçme, e-Değerlendirme basamaklarından oluşur. Analitik yöntemler klasik veya aletli yöntemler olarak sınıflandırılabilir.

1.4 Klasik (yaş) yöntemler Gravimetrik, volumetrik analiz gibi yöntemleri içerir. Kimyasal maddeler, terazi, kalibre edilmiş cam malzeme, ısıtıcı gibi basit laboratuvar malzemelerinin kullanıldığı ve genelde analitin (tayin edilecek madde) daha fazla bulunduğu numunelerin analizinin yapıldığı yöntemlerdir. 1.5 Aletli Analiz Yöntemleri Genel laboratuvar cihazlarının yanı sıra, çeşitli analitik cihazların kullanıldığı yöntemlerdir. Analitik cihazlar, maddenin, iletkenlik, elektrot potansiyeli, ışın absorpsiyonu veya emisyonu, kütle yük oranı, floresans gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerini ölçer. Numuneyi analiz etmek amacıyla bazı bileşenleri ayırmak için kullanılan kromatografik, elektrolitik, elektroforetik yöntemler de aletli analiz yöntemlerindendir. Aletli yöntemler genellikle, zamandan tasarruf etmek, birçok kimyasal ayırmalardan kaçınmak ve çoğu kez daha duyarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için kullanılır. 1.5.1 Enstrümental Analiz: Bir örnekteki herhangi bir bileşenin cinsi veya derişimiyle orantılı sinyal üreten cihazlarla yapılan analize Enstrümental Analiz denir. Gıda analizlerinde aletli analiz yöntemleri başlıca 5 grupta toplanır. · Spektroskopik Metotlar · Elektrokimyasal Metotlar · Kromotografik metotlar · Termal analiz metotları · Refraktometrik ve Polarimetrik metotlar 1.5.2 Enstrümantal Metotlar 1920’li yıllara kadar analizlerin kütle ve hacim özelliklerine göre yapılıyordu. Bu nedenle gravimetrik ve volumetrik analizler “klasik yöntemler” olarak tarif edilir. Diğer yöntemlere ise (spektroskopik, elektroanalitik, kromatografik vb). “enstrümantal analiz yöntemleri” denilmektedir. Aşağıda analitik uygulamalarda kullanılan ve çok bilinen bazı sinyallerle bu sinyal ölçümüne dayanan analitik metotlar verilmiştir.

Ölçülen Özellik Aletli Analiz Yöntemi Işın Absorpsiyonu Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi Işın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans, Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi Işın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi Işın Kırılması Refraktometri, interferometri Işın Difraksiyonu X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri Işın rotasyonu Polarimetri, dairesel dikroizm Elektrik potansiyeli Potansiyometri, Kronopotansiyometri Elektrik yükü Kulometri Elektrik akımı Amperometri, Polarografi Elektriksel direnç Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü) Kütle Gravimetri Kütle/yük Kütle spektroskopisi Tepkime Hızı Kinetik yöntemler Termal Özellikler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik, DSC Radyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri Tablo 1.1 Bazı aletli analizlerin dayandığı yöntemler Birbirine çok benzeyen maddelerin ayrılması için yukarıda verilen yöntemlerden başka analitik ayırma yöntemleri de vardır. Kromatografi, destilasyon, ekstraksiyon, iyon değiştirme, fraksiyonlu kristalizasyon, ve seçimli çökeltme işlemleri çeşitli ayırma ve saflaştırma yöntemleridir.

Enstrümantal tekniklerin çoğu klasik yöntemler kadar hassas değildir. Karışımların analizlerinde ise enstrümantal yöntemler daha başarılıdır. Enstrümantal veya klasik analizler için doğruluk, uygunluk ve harcanan zaman gibi kıstaslara göre genel bir sınıflama yapılamaz. Hatta kullanılan cihazlar yönünden bile, daha pahalı veya daha karmaşık, gibi bir ayırım bile doğru olmaz; örneğin, gravimetrik bir analizde kullanılan modern bir terazi bazı enstrümantal analiz cihazlarından daha karmaşık ve pahalı bir cihazdır. 1.5.3 Analiz Cihazları (Enstrümanlar) Bir cihazın temel kısımları çoğunlukla dördü aşmaz. Şekilde şematik olarak görüldüğü gibi bu kısımlar: v Sinyal jeneratörleri v Dedektörler (giriş dedektörleri) v Sinyal prosesörleri (devreler ve elektrik aletleri) v Veri okuma aletleri 1.5.3.1 Sinyal Jeneratörleri Sinyal jeneratörleri örnekteki maddelere ait analitik sinyaller üretirler. Jeneratör örneğin kendisi olabilir. Analitik bir terazinin sinyali tartılan örneğin kütlesidir; bir pH metre için ise sinyal, çözeltideki hidrojen iyonlarının aktivitesidir. Diğer cihazların çoğunda sinyal jeneratörü çok ayrıntılıdır. Örneğin, IR Spektrofotometrede sinyal jeneratörü, ışın kaynağı, monokromatör, ışın chopperi (kesici), ayırıcı, örnek tutucu ve ışın aftenuatörü (zayıflatıcı) gibi kısımlardan oluşur. Diğer bazı örnekler: Fotometre: Tungsten lamba, cam filtre, örnek Atomik Emisyon Spektrometre: Alev, mono-kromatör, kesici, örnek

Kulometre: DC kaynak, örnek pH Metre: Örnek/cam elektrot X-Işını Toz Difraktometre: X-ışını tüpü, örnek Renk Komparatörü: Güneş ışını, örnek 1.5.3.2 Giriş Transduserleri veya Dedektörler Transduser bir tip sinyali başka bir sinyal tipine çeviren bir alettir. Örneğin, ışığın ısısını elektrik voltajına çeviren termokupl bir transduserdir; kadranlı bir barometredeki körükler basınç sinyalini mekanik bir hareket sinyaline dönüştürürler. Enstrümental analiz cihazlarında karşılaşılan transduserlerin pek çoğu analitik sinyalleri elektrik voltajı, akım, veya dirence dönüştürürler; çünkü elektrik sinyalleri yükseltilebilir ve kaydedicide çizim veya yazım şeklinde alınabilirler. Fotosel: Elektrik akımı Fotomultiplier tüp: Elektrik potansiyeli Elektrotlar: Elektrik akımı Cam-kalomel elektrolar: Elektrik potansiyeli Fotoğraf filmi: Görüntü Göz: Optik sinyal 1.5.3.3 Sinyal Prosesörleri Sinyal prosesörü dönüştürülmüş sinyali, okuma aletine en uygun olacak şekilde değiştirir. En fazla karşılaşılan değiştirme sinyalin kuvvetlendirilmesidir (amplifikasyon). Bunun için sinyal 1’den büyük bir sabitle çarpılır. İki kefeli bir analitik terazide kolun hareketi, bir gösterge ile kuvvetlendirilmiş olarak iletilir. Bir fotoğraf filmi tarafından yapılan kuvvetlendirme çok daha büyüktür; burada tek bir foton 1012 tane gümüş atomu üretir. Elektrik sinyalleri de keza 106 kat veya daha fazla kuvvetlendirilebilirler. Elektrik sinyallerinin kuvvetlendirilmesi yanında, zayıflatılmasına (attenuasyon) da gereksinim olur; bu durumda sinyal, prosesörde 1 den küçük bir sabitle çarpılır, integre edilir, ayrılır, eklenir veya çıkarılır. Bundan sonraki uygulamalarda sinyal önce alternatif akıma ve sonra da doğru akıma çevrilerek bir standartla kıyaslama yapılabilir. Böylece akımdan voltaja (veya tersine) bir geçiş sağlanmış olur.

1.5.3.4 Veri Okuma Sistemi Veri okuma sisteminde, prosesörden yükseltilerek gelen sinyali kişinin okuyabile-ceği bir sinyale dönüştüren bir transduser bulunur. Bunlar metreler, şerit kağıtlı kaydediciler, osilaskoplar, işaretli cetveller, ve digital (rakamlı) göstergeler olabilir. 1.5.4 Analitik Metot Seçimi Problemin tanımı: İstenilen doğruluk ve hassasiyet nedir? Elimizdeki örnek ne kadardır? Analitin konsantrasyon aralığı nedir? Örnekte girişime yol açacak bileşenler nelerdir? Örnek matrisinin fiziksel ve kimyasal özellikleri nelerdir? Kaç örnek analizlenecektir? Analitik metot seçimi için sayısal kriterler: Kullanılacak cihazların performansının metot için yeterli olup olmadığı doğrulanır. Kullanılacak maddelerin (kimyasal, standartlar) kalitesi belirlenir. Validasyonu yapılacak metot performans parametreleri metodun uygulama amacına ve kapsamına bağlı olarak belirlenir. Metot validasyonuna başlamadan önce kullanılacak cihazın performansının test edilmesi ve uygunluğunun saptanması da gerekir. 1.5.5.1 Metot Validasyonu Metot validasyonu, bir analitik metodun ilgilenilen amaç için kabul edilebilirliğini sağlama işlemidir. Metot problemlerini en aza indirmek için en iyi yol, geliştirme esnasında uygun validasyon deneylerini gerçekleştirmektir. Metot validasyonu; metodun amaç için uygun olduğunu kanıtlamayı içerir. İlaç analiz metotları için, Birleşik Devletler Farmakopisi (USP), Uluslararası Harmonizasyon Konferansı (ICH), Gıda ve İlaç İdaresi (FDA)’nin verdiği talimatlar böyle bir validasyonu gerçekleştirmek için bir çerçeve sunar. Ne tür bir çalışma yapılması gerektiği konusunda genel bir uyum varsa da, nasıl yapılacağı konusunda büyük farklılıklar bulunmaktadır. Analiz edilecek aktif maddeye, örnek matriksine ve bu analizleri yapacak gruba bağlı olarak validasyon ihtiyaçları sürekli değişir. 1.5.5.2 Metot Validasyonunun Gerekli Olduğu Durumlar · Herhangi bir metodun laboratuvarda ilk defa kullanılacağı zaman, · Bir analiz için yeni metot geliştirildiğinde, · Kullanılmakta olan metotta değişiklik yapıldığında, · Valide bir metodun başka bir laboratuvarda kullanılacağı durumlarda,

· Yeni personel tarafından metodun ilk defa kullanılması durumunda, · Yeni cihazlar devreye girdiğinde, · Temel kimyasallarda önemli bir değişiklik yapıldığında (metot Modifiye edildiğinde), · Uzun süredir kullanılmamış bir valide yöntemin yeniden kullanıma alınması durumunda, · Laboratuvarda yapılan ve sonuçları etkileyebileceği düşünülen değişiklikler olduğunda, · İki metodun karşılaştırılması amacıyla ve · Kalite kontrol testleri sonucunda metodun performansında zamanla bir değişme olduğu anlaşıldığında metot validasyonu / verifikasyonu yapılır 1.5.5.3 Metot Validasyon Parametreleri Metot geçerliliği, herhangi bir analitik metodun hedeflenen amaca göre kabul edilip edilemeyeceğini açıklayan performans kriterlerinin istatistiksel değerlendirilmesidir. Enstrümental cihazlarla yapılan analizlerde, metot validasyonu belirli bir örnek veya örnek matriksleri için geliştirilen metodun, geçerliliğinin ya da çalıştığının sağlamasının yapılmasıdır. GLP ye uygun çalışan laboratuvarlar sadece geçerliliği onaylanan metotları uygularlar. Geçerliliği kanıtlanmış metotlarla çalışmak laboratuvarda analiz süresince karşılaşılabilecek problemlerin çoğunun ortadan kaldırılmasını sağlar. Bir çok metot performans kriterleri vardır: gerçeğe yakınlık (accuracy), kesinlik (precision) doğrusallık (linearity), kalibrasyon, geri alım (recovery), LOD (dedeksiyon limiti), LOQ (hesaplama limiti), hassasiyet (sensitivity), hedef (scope), özgülük (specifity). Fakat çoğu araştırıcılar bu kriterlerden doğruluk, kesinlik (repeatability, reproducubility, robustness), kalibrasyonun doğrusallığı değerlendirmelerine önem vermektedirler. Bazen validasyon çalışmalarının sonucu uygulanan analiz prosedürünün değiştirilmesini gerektirebilir, bunun için de metodu tekrar valide etmek gerekir. Metot validasyonunun birçok seviyesi vardır. En düşük seviyeli olanı bir analizcinin bir tek laboratuvarda örneklerini fortifiye etmesi gerekli verileri toplaması ve istatistiksel değerlendirme yapmasıdır. En yüksek seviyeli olanı ise konsantrasyonu bilinmeyen analit içeren örneklerle birçok laboratuvarın ortaklaşa çalışması ve verilerin toplanması ve değerlendirilmesidir. Metod performance parametrelerini United States Pharmacopeia (USP), Inernational Conference on Harmonisation (ICH) ve Food and Drug Administration (FDA) gibi uluslararası kuruluşlar bir rehber yada kılavuz olarak açıklamışlardır. · Doğruluk (Accuracy) o Gerçeklik (Trueness) ve Sistematik Hata (Bias) · Kesinlik (Precision) o Tekrarlanabilirlik (Repeatability)

…