Direk sayım yöntemi (mikroskobik sayım) sıvı gıdaların veya kültürlerin içerdiği toplam mikroorganizma miktarının belirlenmesinde kullanılır. Ancak bu teknikle canlı veya cansız hücreyi belirleyici bir ayrım yapılamamaktadır. Mikroorganizma tipine göre boyanmış veya boyanmamış preparatlarda direk sayım yapılır. Ancak boyama öncesi süt gibi yağlı örneklerde yağın alınması amacıyla ksilol ve alkol kullanılır.
Direkt Sayım Yöntemi: 0.01 ml örneğin 1 cm2’lik alana yayılarak mikroorganizmaların sayılması yöntemine dayanır. Bunun için önce mikroskop görüş alanını (MA) bulunmalıdır. Mikroskop Alanının Belirlenmesi:Yöntemin uygulanmasında mikroskop alanının belirlenmesi için mikrometrik lamdan yararlanılır. Bu lamın üzerinde her bir aralığı 10m olan, 100 bölmeli, toplam 1mm’ yi gösteren çizgiler bulunur.
Materyal:
• Objektif mikrometre • Sedir yağı • Mikroskop(100*obj) Metot: ¨ Mikrometrik lam mikroorganizma tablasına yerleştirilir ve sonra az büyütmeli objehtif kullanılarak çizgilerin mikroskop sahasının tam ortasına gelmesi sağlanır. ¨ Bir damla immersiyon yağı mikrometrik lam üzerine damlatılır ve 100 lük objektifle görüntü ayarlanır, alanın çapı mikrometre cinsinden ölçülür. ¨ Ölçümün yapıldığı öküler ve objektifle mikroskop alanı mm2 cinsinden pr2 formülüne göre hesaplanır, bu formülde r yarıçaptır. Mikroskop faktörünün bulunması: Mikroskop faktörü 1 cm2’lik alandaki görüş sahası sayısıdır (1 cm2 / görüş sahası sayısı). Bir mikroskopta 10X oküler, 10 objektif ve 160 mm tüp boyu bulunduğunda mikroskop faktörü 2500-5500 arasında değişir. Bu değerlerden çok farklı sonuç elde edildiğinde hesaplamalar kontrol edilmelidir. Mikroskop görüş sahasının alanı belirlendikten sonra sıvı örnekte ki mikroorganizma sayısı bulunur. Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi: Bu sayım yöntemi hızlı olması, inkübasyon süresine gerek olmaması nedeniyle gıda bilimi ve endüstrisi açısından önemlidir.
Sütte Mikroorganizma Sayımı
Süt mikroorganizmalarının gelişmesi için ideal bir besi ortamıdır. İnek sütünün ortalama kimyasal bileşimine ilişkin Tablo (1)’de verilen değerlerdende anlaşılacağı gibi süt karbonhidrat, protein, mineral ve vitaminler yönünden mikroorganizmaların gelişmeleri için gerekli tüm besin öğelerini uygun oranlarda içermektedir. Kimyasal bileşim yanında normal sütün pH değeri 6,4-6,8 arasında değişmekte olup bakteriyal gelişmeye çok uygundur. Redoks potansiyeli ise daha çok aerobik mikroorganizmaların üremesine elverişlidir. Süt ürünlerinde mikroorganizmalar üç ana nedenle önem taşırlar: 1.Peynir, fermente süt ve tereyağı gibi ürünlerin yapımında arzulanan lezzet, aromave fiziksel özelliklerin oluşmasını sağlarlar. 2.Süt ve süt ürünleri patojen mikroorganizmalar veya mikrobiyal toksinlerle kolayca kontamine olabilirler ve böylece hastalık ve zehirlenmelere yol açarlar. 3.Pek çok mikroorganizma türü süt ve ürünlerinde tat, aroma ve yapı bozukluk ve kusurlarına neden olabilirler.
Materyal:
• Süt örneği • Öze, lam • Ksilol • Alkol • Saf su • Metilen mavisi • Filtre kağıdı • Mikroskop
Metod:
¨ Temiz bir lama bir mikropipet yardımıyla 0.01 ml süt örneği damlatılır. ¨ Lamın altına önceden 1cm2’lik alan işaretlenmiş (1cm2 kağıt yapıştırılmış) bir başka lam konarak bir öze yardımıyla süt yayılır ve kuruması için bir süre beklenir. ¨ Bu lam içinde ksilol bulunan bir behere daldırılarak 1 dakika beklenir. Ksilolun görevi sütteki yağı uzaklaştırmak ve bakterilerin lama yapışmasını sağlamaktır. ¨ Aynı lam içinde %76’lık alkol bulunan bir başka behere 1 dakika daldırılır. Alkolün görevi ksilolü uzaklaştırmaktır. ¨ Lam bir piset yardımıyla yavaşça saf su ile yıkanarak bu kez alkol uzaklaştırılır. Su basınçlı olursa örnek lam üzerinden akıp gidebilir. ¨ Lam üzerine metilen mavisi damlatılarak 30 saniye beklenir. ¨ Yavaşça saf su ile yıkanır, filtre kağıdı ile kurutulur. Boyama fazla olmuşsa yeniden alkole batırılarak renk açılır. Tekrar su ile yıkanarak, kurutulur. ¨ Lam üzerine 1 damla sedir yağı damlatılarak mikroorganizmalar sayılır.
Sonuçların değerlendirilmesi:
Bu yöntemle sayımda bir tek sah sayılarak karar verilemez. Mikroskop faktörü ve örnekteki bakteri sayısı esas alınarak sayılması gereken alan sayısı aşağıdaki tabloda gösterilmiştir.
Sayım sırasında mikroorganizma görünmeyen sahalar 0 olarak değerlendirilir. Örnek: Mikroskop faktörü 5000 ve örnekteki mikroorganizma sayısı yaklaşık 7.105 ise 20 sahada sayım yapılarak ortalaması alınmalıdır. 1ml deki mikroorganizma sayısı = A * MF * 100 formülü ile bulunur. Bu formülde; A : Farklı sahalarda yapılan sayımların ortalaması MF : Mikroskop faktörü’ olarak kabul edilir. Sayım 0.01 ml de yapıldığından sıvı gıdada 100 ile çarpılarak katı gıdada ise 1000 ile çarpılarak ( 0.01 ml 1/10 luk dilüsyondan alınmıştır ) 1 ml deki bakteri sayısı bulunur.
Sonuçlar:
Dairenin çapı: 17 aralık Her aralık 10 mikrometreye geldiğinden; Çap: 17*10= 170 mikrometre Yarıçap(r): 170/2 = 85 mikrometre = 0.085 mm Mikroskop görüş sahasının alanı ise; S: 3.14*0.0852 = 0.0226865mm2 Mikroskop faktörü: 1/0.0226865 = 4407,9077 1 ml’ deki mikroorganizma sayısı: 8*4407,9077*100 = 3526326.16 = 3.106 Tablodan sayılması gereken alan sayısının 10 olduğu belirlenir. Sayılan10 alanın ortalaması alınır ve 12 bulunduğundan bu rakam tekrar formülde yerine koyulur: 12*4000*100 = 4,5 106 mikroorganizma / ml bulunur.
Yorum:
Açıkta 24 saat beklemiş süttün 1 ml’ sinde bulunan mikroorganizma sayısın insan sağlığı için tehlikeli boyutlarda olduğu söylenebilir
Ek:
Çiğ sütlerde mikrobiyal bozulmalar: Çiğ sütlerde rastlanan istenmeyen lezzet ve fiziksel değişimler mikrobiyal faaliyetler sonucu ortaya çıkmaktadır. Bozulma çeşitleri ve etmeni olam mikroorganizmalar tablo (3)’de verilmiştir.
Kaynaklar:
¨ HEPERKAN, D.1998, Basılmamış Veri,Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, İTÜ Gıda Mühendisliği Bölümü, İstanbul ¨ BORCAKLI, M.; KALAFATLIOĞLU, H.; ARAN, N.; TOPAL, Ş. ve KARAKUŞ, M. 1994, Gıdalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri, TÜBİTAK MAM Gıda ve Araştırma Bölümü, yayın No: 128, Gebze-MAM ¨ KARAKUŞ, M. 1995,Gıda Sanayinde Mikrobiyoloji ve Uygulamaları, TÜBİTAK MAM Gıda ve Araştırma Bölümü, yayın No: 124, sayfa 82-85, Gebze-MAM
