Rekombinant-DNA teknolojisinin gelişimindeki önemli atlama taşları:
1953 Watson ve Crick : DNA’ nın çift iplikli sarmal yapısı keşfedildi.
1957 Kornberg : DNA polimeraz izole edildi.
1966 Nırenberg ve ark: Genetik kod çözümlendi.
1967 Gellert : DNA ligaz izole edildi.
1972-73 Jackson ve ark : İlk r-DNA molekülü oluşturuldu. Boyer ve ark : Gen klonlama tekniğinde plazmidler keşfedildi
1975 Southern : hibridizasyon tekniği geliştirildi. ” Southern Blot tekniği”.
Kan ve ark : ilk prenatal teşhis
1979 Goeddel ve ark: ilk rekombinant – insülin
1982 Palmiter ve Brinster : Transgenik fareler
Spradling ve Rubin : Transgenik meyve sinekleri üretildi.
1993 Stilman ve Hall : İnsan embriyosunun klonlanması çalışmaları
1997 Wilmut : Koyun klonlanması (Erişkin memeli hücrelerinden)
1998 İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı
2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003)
DNA çipleri
Farmakogenetikte atılımlar
Kök Hücre – tedavi
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler
Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi
DNA nın Klonlanması
DNA – nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması
Nukleik asit hibridizasyonu
Genetik Mühendisliği
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler – 1
Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi

HpA I 5′ G-T-T * A-A-C 3′
3′ C-A-A * T-T-G 5′
Eco RI 5′ G *A-A-T-T-C 3′
3′ C-T-T-A-A * G 5′
Hind III 5′ A *A-G-C-C-T 3′
3′ T-T-C-G-G * A 5′
Pst I 5′ C-T-G-C-A * G 3′
3′ G * A-C -G-T-C 5′
Restriksiyon enzimleri (DNA makasları)
RFLP (Parça uzunluk polimorfizmi)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler – 2
DNA – nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması
Enzimatik Yöntem (Sanger Yöntemi)
Kimyasal yöntem (Maxam-Gilbert Yöntemi)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler- 3
Nukleik asit hibridizasyonu:

Southern transferi : DNA hibridizasyonu

Nouthern transferi : RNA hibridizasyonu

Rekombinant dna teknolojisinde kullanılan yöntemler – 4
DNA Klonlaması
Vektör kullanarak canlı hücrede
DNA çoğaltımı ;
*Plazmid
*Virus genetik materyeli
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltım işlemi (tüpte)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR veya PCR)
Kalıp DNA
DNA polimeraz (Yüksek ısıya dayanıklı)
Primerler
dNTP ler ( CTP-ATP-GTP-TTP)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler – 5
Genetik Mühendisliği
Transgenik hayvan ve bitkiler üretmek
Transgen: Yabancı gen (veya DNA)
Transgenik: Yabancı geni taşıyan organizma
Transgenik model oluşturmak:
Hücrelere yeni gen nakli ( bir gen üzerinde değişiklik yaptıktan sonra -mutant gen- normal genin yerine sokulması) ile farklı özellikler taşıyan organizmaların üretilmesi.

Transgenik hayvan oluşturma yöntemleri;

1- Döllenmiş yumurtaya gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi

2- Embriyonik kök hücrelerine (EKH) gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi
Rec- DNA Teknolojisinin Kullanıldığı Alanlar
Rekombinant DNA teknolojisinin biyomedikal önemi
Birçok hastalığın moleküler temelini anlamak (ailesel hiperkolesterolemi, orak hücre anemisi, talessemi, kistik fibroz, müsküler distrofi)
Rec-DNA teknolojisi kullanılarak tedavi etmek (örn: insülin, büyüme hormonu, plazminojen aktivatörü)
Aşılar üretmek (hepatit B)
Tanı (AIDS testi)
Tedavi (gen tedavisi)
Prenatal tanıda
Beta thalessemia,
Duchenne müsküler distrofi,
Frajil-X sendromu
Kanser teşhisinde
retroviruslar
Onkogenler
Mutant genler
Aşı üretiminde
Yenebilir aşıların üretimi
Muz patates gibi ürünlere hepatit B, Kolera aşılarının klonlanması
“Çocuklar ölmesin
Şekerde yiyebilsinler”
Biyoteknolojik çalışmalarda
Çevre mühendisliğinde biyolojik savaş
süper bakteriler
oktan, ksilen, naftalin ve karışık hidrokarbonlar gibi petrol artıklarını kullanabilen bakteri türlerinden , tüm bu özellikleri bir arada taşıyan mikroorganizma.

Hastalıkların moleküler seviyedeki patolojik tanıları

Diyabet
ateroskleroz ve koroner arter hastalıkları
Alzheimer , şizofreni, parkinson
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 1
proteinleri kodlayan genlerde meydana gelen mutasyonlar sonucu hasarlı veya eksik protein üretimine dayanır.
Bu patolojilere göre genetik hastalıklar
Bir proteinin alt gruplarını oluşturan proteinlerde mutasyon
Thalessemia’ ler (Otosomal resesif)
Enzim hasarları
Aminoasidopatiler;Fenilketonuri, (Otosomal resesif)
Lizozomal depo hastalıkları; Tay-Sacs hastalığı
(Otosomal resesif) .
İnklüzyon –hücre hastalığı (protein trafiğindeki hata)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 2
Reseptör proteinlerindeki hatalar ve eksiklikler
Ailesel Hiperkolesterolomi (Otosomal dominant)
Transport proteinlerindeki hatalar
Kistik fibrozis (Otosomal resesif)
Yapısal proteinlere bağlı hastalıklar
Ducshenne Müsküler distrofi ( Kasta Distrophin
protein eksikliği ) (X’e bağlı)
Osteogenesis imperfecta ve Ehlers Danlos
( kollogen sentez hataları )
(Otosomal dominant)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 3
Nörodejenaratif hastalıklar
Alzheimer Hastalığı (Otosomal dominant veya çok nedenli)
Büyüme veya farklılaşma proteinlerinde hasarlar
Kalıtsal meme ve ovaryum kanserleri :
( BRCA1- BRCA2 mutasyonlarına bağlı ) (otosomal dominant)
Viral ve bakteriyal enfeksiyonlarda patojenin tespitinde
Tüberküloz bakterisinin tespiti m . tuberculosis (PCR ile ) ayrıca alt tiplerinin tayini
Hepatit virusu
Herpes simplex
onko-virusların tayini
Adli Tıpta
şüpheli suçlunun tayini
veya
babalık tayini
Gen Tedavisi
AMAÇ: Mutant fenotipi düzeltmek
Gen tedavisi için kullanılan vektörler:
Viral Vektörler:
* Retroviruslar
* Adenoviruslar
Viral Olmayan Vektörler :
* Çıplak DNA (plazmid içine sokulmuş hedef DNA)
* Lipozomlar içine sokulmuş DNA paketleri
* Protein-DNA bileşenleri (hücre yüzey
reseptörlerine bağlanan protein ve DNA bileşeni)
* Yapay kromozomlar
Retroviruslar:
viral genom, konak hücre DNA’sına katılır.
Adenoviruslar:
viral genom, konak hücre DNA’sına katılmaz
kromozom dışında sitoplazmada genetik
materyal olarak bulunur.
insersiyonal mutasyona neden olmaz.
Gen transferinde çeşitli yöntemler vardır:
Rekombinant- DNA’nın lipid vezikülleri (lipozomlar) ile hücreye sokulması.
Virus genomu içine ilgili DNA parçasının sokularak tranfeksiyon
Nukleus içine mikroenjeksiyon ile rekombinant- DNA’nın sokulması.
Gen tedavisi
Vektörler iki yoldan organizmaya verilir
Ex vivo: Organizma dışına alınan mutant hücrenin düzeltilerek yeniden organizmaya verilmesi
In vivo: Dışarıda hazırlanan normal geni taşıyan vektörün organizmaya verilmesi
Gen tedavisi örnekleri
Ex vivo
SCID: Ciddi kombine immun yetmezlik hastalığı
Adenozin deaminaz (ADA ) mutasyonu
Kemik iliğinden kan kök hücreleri çıkarılır.
Sağlam gen bir vektör yardımı ile kök hücreye nakledilir.
Kök hücre organizmaya geri sokulur.
DMD : Duchen müsküler distrofi :
Distrofin proteini mutant.
Gen tedavisi örnekleri 1
Ailesel Hiperkolesterolemi ;LDLR:

Düşük dansiteli lipoprotein reseptör geninde mutasyon.
(LDLR: Karaciğerde sentezlenir ) Kalp ve damar hastalıklarına yatkınlık nedeni

LDLR- / LDLR- hastaların karaciğer hücreleri alınır, normal gen retroviruslar ile hepatositlere sokulur, düzeltilmiş hücreler portal ven ile vücuda verilir.

Gen tedavisi örnekleri 2
İn vivo
Kistik fibroz:
Klor kanal proteini mutant.
Adenoviruslara normal gen sokulup sprey yolu ile burun mukozasına verilir.

Klonlama
Dolly
1996 da Keith Campbell and Ian Wilmut tarfından Roslin enstitüsünde, (Edinburgh, İskoçya) da klonlandı
Mikroenjeksiyon
İnsan Genom Projesi

…