1.0         AMAÇ VE KAPSAM

Bu metot kahvede HPLC yöntemi ile kafein miktarının tespitini kapsar.

2.0         PRENSİP

Magnezyum oksitli ortamda 90˚C sıcaklıktaki su ile deney numunesinden kafeinin ekstraksiyonu, süzülmesi ve bir UV dedektörün kullanıldığı HPLC tekniği ile kafeinin tayini esasına dayanır.

3.0         ALET VE EKİPMANLAR

–        HPLC, UV dedektörlü

–        HPLC için kromotografik kolon ( C18 )

–        Saflaştırma kolonu ; ters faz için ( en fazla on işlem kullanılabilir )

–        Filtreler; 0,45 μm

–        Su banyosu ( 90˚C )

–        Analitik terazi ( 0,001 g hassasiyette )

–        Kahve değirmeni

–        Vialler

–        Disposable enjektör

–        Genel laboratuvar cihaz ve malzemeleri

4.0           KİMYASAL MADDELER

–     Metanol ; HPLC saflıkta

–     Amonyak çözeltisi ( 0,3 mol/l ) / metanol ; 90/10 hacmen

–     Yıkama çözeltisi ( saflaştırma kolonu için ) metanol/su/asetik asit; 75/25/1 hacmen

–     Taşıyıcı faz ; metanol/ su  karışımı ; 30/70 hacmen

–     Etanol/su karışımı ¼ ( v/v )

–     Magnezyum oksit

–     Stok kafein çözeltisi; 0,500g kafein / L ( etanol / su karışımı ile hazırlanır ) Bu çözelti buzdolabında en fazla bir ay muhafaza edilebilir.

–     Standart kafein çözeltileri; standart kafein çözeltileri A ve B  kullanılacağı gün hazırlanmalıdır.

–     Standart kafein çözeltisi A ; 0,010g kafein / L  ( stok kafein çözeltisinden 2,0 ml alınıp su ile 100 ml’ye seyreltilir. ) Kafeini alınmış mamuller için kullanılmalıdır.

–     Standart kafein çözeltisi B ; 0,050 g kafein /L ( stok kafein çözeltisinden 10 ml alınıp su ile 100 ml’ye seyreltilir. ) Kafein içeren mamuller için kullanılmalıdır.

5.0         UYGULAMA

5.1.    Numune hazırlama ve kafeinin ekstraksiyonu :

·         Gerekiyorsa numune öğütülür.  Normal, kafeinsiz yeşil veya kavrulmuş kahve numunesinden 0,0001 hassasiyetle 1 g. normal ve kafeinsiz çözünebilir  kahve için 0,5 g. numune  250 ml’lik şişeye tartılır.

·         Şişedeki kahveye  4g + 0,5 g magnezyum oksit ve 100 g  su ilave edilir. Kapağı kapatılır ve 0,1 g hassasiyetle tartılır.

·         Şişe içindekiler karıştırılır. Kapağı kapalı bir şekilde 90˚C’deki su banyosunda 20 dk. sürekli çalkalanarak ısıtılır.

·         Şişe su banyosundan çıkarıldıktan sonra soğutulur, kurulanır ve 0,1 g hassasiyetle tartılır. Soğutulmuş ve kurulanmış şişenin ağırlığı önceki tartıma eşit olmalıdır.

·         İçindekilerin dibe çökmesi için  bekletilir, kapağı açılır ve solüsyondan bir kısım  0,45 μm’lik filtreden süzülür.

·         Solüsyonda bir ayrım gözlenmeden saflaştırma kolonu aktifleştirilir. ( Musluğunu aç, ve kolonu damla damla akacak şekilde 5 ml metanolle yıka. Silikanın üzerinde 1-2 mm metanol kalınca musluğu kapat. 5 ml su ilave et ve aynı metanoldeki gibi işlem yap. Kolonun kurumasına izin verme, aksi taktirde hazırlık tekrarlanmalıdır. )

·         Kolona, normal veya çözünebilir kahve için  çöktürmeden önceki aşamadan 2 ml, kafeinsiz kahve için çöktürmeden sonra 10,0 ml kolona koy. Musluğu damla damla akacak şekilde ayarla. Solüsyon silika yüzeyi seviyesine düşünce musluğu kapat.

·         Musluğu aç, 2,5 ml amonyak/metanol  karışımından ilave et. Silika seviyesine düşünce musluğu kapat.  Tekrar 2,5 ml aynı karışımdan ilave et ve tamamen akıt. Yaklaşık 20 ml hava geçir. ( bu aşamada kolon kuruyabilir )

·         Kolonun altına 10 ml’ lik balon yerleştir. Damla damla geçecek şekilde musluğu aç ve  7,5 ml yıkama çözeltisi ilave et ve hepsini kolondan geçir. Balonu su ile çizgisine kadar tamamla.

5.2. HPLC çalışma şartları :

·      Kolon : C18

·      Enjeksiyon miktarı : 10 μm

·      Taşıyıcı faz akış hızı : 0,5-1,5 ml / dk

·      Kolon sıcaklığı : 40˚C ( şartların  optimize edilmesi durumunda 60˚C’ aşmamak gerekir )

·      Dalga boyu : 280 nm

6.0         HESAPLAMA

Kafeinli kahveler için :

% Kafein içeriği  ( m/m ) = A_x/ A_C x c₁x ( 10×100) / (2xm₀x1000)x ( 100/RS ) x 100

Burada ;

A_x = Deney çözeltisinin verdiği kafein pikinin alanı

A_c = Standart kafein çözeltisinin verdiği kafein pikinin alanı

C₁ = Standart kafein çözeltisinin konsantrasyonu g / L

M₀ = Deney için kullanılan numunenin kütlesi

RS = Deney numunesinin kuru madde içeriği

Kafeinsiz kahveler  için :

% Kafein içeriği  ( m/m ) = A_x/ A_C x c₂x ( 10×100 ) / (10xm₀x1000)x ( 100/RS ) x 100

Burada ;

C₂ = Standart kafein çözeltisinin konsantrasyonu g / L

7.0         KAYNAK

ISO 10095 / Ocak 1992