Bu yöntem, hidroksimetil furfurolun paratoluidin ve barbutirik asit arasındaki reaksiyon sonucunda ortaya çıkan rengin spektrofotometrede okunması ilkesine dayanır.
01.02. Kullanılan Kimyasallar
Paratoluidin çözeltisi: 10 g paratoluidin 50 mL isopropanol içerisinde, su banyasunda çözdürülür. Çözelti 100 mL’lik balonjojeye aktarılır. Kap az bir miktar isopropanol ile yıkanarak bu çözeltide balonjojeye aktarılır. Balonjojeye 10 mL buzlu asetik asit eklenir. Oda sıcaklığında soğutulur ve hacim çizgisine kadar isopropanal ile seyreltilir. Çözeltinin başlangıçtaki renksiz halinin kahverengiye dönüşmesi kullanımını engellemez. Çözelti il 24 saat içerisinde kullanılmamalıdır. Koyu renkli bir şişede saklanılırsa 6 ay kullanılabilinir.
Barbütirik asit: 500 mg barbütirik asit 100 mL ‘lik balonjojeye alınarak üzerine 60-70 mL saf su eklenerek su banyosu içerisinde çözündürülür. Oda sıcaklığında soğutulduktan sora hacim çizgisine kadar saf su ile seyreltilir.
Damıtık oksijensiz su: İyice kaynatılmış olan damıtık su içerisinden azot gazı geçirilerek soğutulduktan sonra ağzı sıkıca kapatılarak saklanır.
01.03. Deneyin Yapılışı
Sıvı haldeki ballar iyice karıştırılarak homojen hale getirilir. Eğer içerisinde kristaller oluşmuş ise sıcaklı 60°C’yi ve 30 dakika süreyi geçmemek şartı ile su banyosunda ısıtılark kristallerin çözünmesi sağlanır.
Petekli ballarda ise numune peteğin uzunluğu boyunca kesilerek alınmalıdır. Bal delik büyüklüğü 0.5 mm olana kare delikli elekten süzülerek alınır. Süzüntüde bal mumu ve kristaller var ise su banyosunda 40°C’ de ısıtılmalıdır.
Deney numunesinden 10 g tartılır. Isıtılmadan 20 mL oksijensiz saf su içerisinde çözdürülerek 50 mL’lik balonjojeye aktarılır. Hacim çizgisine kadar oksijensiz saf su eklenir.
Hazırlanan bu çözeltiden vakit kaybedilmeden iki ayrı deney tüpüne 2’şer mL örnek çözeltisi koyulur. Üzerlerine 5 mL paratoluidin eklenir. Deney tüplerinden birine 1 mL saf su diğerine ise 1 mL barbütirik asiteklenir. Su eklenen numune tanık çözeltisi olarak kullanılır.
Spektrofotomete cihazı 550 nm’ ye ayarlanarak her iki tarafada tanık çözeltisinden eklenerek cihazın 0 ayarı yapılır. Daha sonra tanık çözeltilerden biri çıkarılarak yerine üzerine barbütirik asit eklenmiş çözeltiden koyularak absorbansı (A) okunur. Bu işlemler mümkün olduğu kadar çabuk yapılmalıdır.
01.04. Hesaplamalar
Hidroksimetil furfurol miktarı (H) ,1 kg balda mg olarak aşağıdaki formül ile hesaplanır.
H = (A) x 192
A: 550 nm’deki örneğin okunan absorbansı
192: Deneyde oluşan renkli maddenin ekstinksiyon katsayısı ve sonuç için şeçilen konsantrasyon
02. Meyve ve Sebze Mamüllerinde Hidroksimetil Furfurol Tayini
02.01. Yöntemin Prensibi
Bu yöntem, hidroksimetil furfurolun paratoluidin ve barbutirik asit arasındaki reaksiyon sonucunda ortaya çıkan rengin spektrofotometrede okunması ilkesine dayanır.
02.02. Kullanılan Kimyasallar
Barbütirik asit: 500 mg barbütirik asit 100 mL ‘lik balonjojeye alınarak üzerine 60-70 mL saf su eklenerek su banyosu içerisinde çözündürülür. Oda sıcaklığında soğutulduktan sora hacim çizgisine kadar saf su ile seyreltilir.
Paratoluidin çözeltisi: 10 g paratoluidin 50 mL isopropanol içerisinde, su banyasunda çözdürülür. Çözelti 100 mL’lik balonjojeye aktarılır. Kap az bir miktar isopropanol ile yıkanarak bu çözeltide balonjojeye aktarılır. Balonjojeye 10 mL buzlu asetik asit eklenir. Oda sıcaklığında soğutulur ve hacim çizgisine kadar isopropanal ile seyreltilir. Çözeltinin başlangıçtaki renksiz halinin kahverengiye dönüşmesi kullanımını engellemez. Çözelti il 24 saat içerisinde kullanılmamalıdır. Koyu renkli bir şişede saklanılırsa 6 ay kullanılabilinir.
%1’lik suda asetaldehit çözeltisi
Standart HMF çözeltisinin hazırlanması: Saf HMF kullanılarak belirli konsantasyondaki çözeltisi hazırlanır. Hazırlanan bu stok çözeltiden değişik konsantrasyonlarda bir dizi standart çözeltisi hazırlanır. 50mg/lt (ppm) konsantrasyona kadar hazırlanan standartlar lineer bir eğri verir.
02.03. Deneyin Yapılışı
02.03.01. Ortamda Sülfüroz Asit varsa
Eğer örnek 10 mg/L’den fazla sülfüroz asit içeriyorsa, deney aşağıdaki şekilde yapılır.
15 mL meyve suyu 25 mL’lik balonjojeye koyulur. Üzerine 2 mL %1’lik astaldehit çözeltisi ilave edilir. Daha sonra hacim çizgisine kadar saf su ile tamamlanır. Örnek süzülür.
Süzüntüden 2 ayrı tüpe 2 ‘şer mL koyulur. Üzerine 5’er mL paratoluidin eklendikten sonra tüplerden birine 1 mL saf su diğerine ise 1 mL barbütirik asit eklenir. Çözeltilerin eklenmesi iki dakika içerisinde gerçekleştirilmelidir. Su eklenen çözelti şahit çözelti olarak kullanılır.
02.03.02. Ortamda Sülfüroz Asit yoksa
2 mL analizi yapılacak numuneden alınarak son hacim 10 mL’ye tamamlanır. Seyreltik örnekten 2 ayrı tüpe 2 ‘şer mL koyulur. Üzerine 5’er mL paratoluidin eklendikten sonra tüplerden birine 1 mL saf su diğerine ise 1 mL barbütirik asit eklenir. Çözeltilerin eklenmesi iki dakika içerisinde gerçekleştirilmelidir. Su eklenen çözelti şahit çözelti olarak kullanılır.
Örnekler hazırlandıktan sonra 3 dakika içerisinde okunmalıdır.
Spektrofotometre cihazı 550nm‘ye ayarlanarak şahit çözelti ile cihazın 0 ayarı yapılır.
02.03.03. Standart eğrinin çizdirilmesi
Analize alınacak homojen hale getirilmiş numuneden 25 mL alınarak üzerine pH’sı 7-8 olana kadar toz sodyum bikarbonat eklenerek çözelti alkali yapılır. Bu sırada oluşacak olan kuvvetli köpürmeyi engellemek için birkaç damla isopropil alkol eklenir. Üzerine 4 mL % 0.5’lik nişasta çözeltisi eklenerek 0.1 N iyot çözeltisi ile mavi renk 15-20 saniye kalıcı oluncaya kadar titre edilir. Elde edilen çözelti 50 mL’lik balonjojeye eklenir. Üzerine 1’er mL Carez I ve Carez II çözeltileri eklenerek hacim çizgisine kadar saf su ile tamamlanır. Çözelti süzülür. Çözeltide oluşan koyu mavi renk HMF konsantrasyonun 50 mg/Lt den fazla olduğunu gösterir. Bu nedenle uygun oranlarda seyreltilmelidir.
Süzüntüden 2 ayrı tüpe 2 ‘şer mL koyulur. Üzerine 5’er mL paratoluidin eklendikten sonra tüplerden birine 1 mL saf su diğerine ise 1 mL barbütirik asit eklenir. Çözeltilerin eklenmesi iki dakika içerisinde gerçekleştirilmelidir. Su eklenen çözelti şahit çözelti olarak kullanılır.
Örnekler hazırlandıktan sonra 3 dakika içerisinde okunmalıdır. Spektrofotometre cihazı 550nm‘ye ayarlanarak şahit çözelti ile cihazın 0 ayarı yapılır. Daha sonra hazırlanan HMF standart çözeltilerinden
