• Düzlemsel kromatografi 1- Kağıt kromatografisi ENSTRÜMENTAL ANALİZ-2 2- İnce Tabaka kromatografisi 1 2 • Kromatografi : Bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını ve • Adsorpsiyon : bir karışımda bulunan sıvı veya tanımlanmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır. Kromatografi yöntemi, ayrılacak bileşenlerin iki faz arasında dağılması esasına dayanır gaz halindeki maddelerin katı faz üzerine Bunlar: tutunmasıdır. • 1) hareketli faz • 2) Sabit faz • Partisyon: Bileşenlerin iki sıvı arasında 1) Sabit faz-durgun faz (Stationary phase): Bir kolon içinde veya düz bir yüzeye dağılması tutturulmuş faz. Geniş bir yüzey alana yayılmış sabit bir yatak oluşturur. • Sabit faz sıvı veya katı olabilmektedir, 2) Hareketli faz (Mobile phase): Durgun fazın üzerinden veya arasından geçen faz. Örneklerin ayrılmasını sağlayan fazdır. • Hareketli faz sıvı veya gaz olabilir. 3 4 Kağıt kromatografisi (KK) Paper chromatography (PC) • KK genellikle kalitatif amaçlı kullanılır. Bazen kantitatif amaçlı kullanılabilmektedir. • Uygulaması en basit olan kromatografi yöntemidir • KK uzun zaman gerektirmesi ve beneklerin daha fazla • genellikle süzgeç kağıtları (selüloz)kullanılarak yapılır yayılması nedeniyle ince tabaka kr kadar başarılı değildir • Bu yöntemde kalın bir süzgeç kağıdı destek; ve gözeneklerine yerlesen su ise, sabit “sıvı fazı” oluşturur. Hareketli faz bir yürütücü tank içine yerleştirilmis uygun bir sıvıdır. • KK sıvı-sıvı partisyon kromatografisidir.

Kağıt kr kullanılan kağıtlar Kullanılan kağıtlar Ticari marka Standart kağıtlar Whatman No.1 ve No. 2 Schleicherr and Schüll (S and S) 2043 n Macheray Nagel(MN) 260 Hızlı akış kağıtları Whatman 31 ET, 54 ve 4 S and S 2040 a Preparatif kartonlar Whatman 31 ET ve 3 MM S and S 2071 Karboksil kağıtlar S and S I ve ıı Asetillenmiş kağıtlar S. and S.2043 b/6, 2043 b/45 ve 2043 b/21, MN 214 Ac, 261 Ac ve 263 Ac İyon değiştirme kağıtları S. and S. Katyon ve anyon değiştirme kağıtları 7 8 KK’de kullanılan sabit fazlar 2) Hidrofilik organik sabit faz 1) Sabit sulu faz: • Bu, sudan başka bir hidrofilik fazın kullanılması durumudur. • Normal kağıt diğer bir sabit fazla doyurulur ve suyun etkisi ortadan kaldırılır. • Suyun sabit faz olduğu ve hareketli fazın bunun üzerinden ilerlediği en yaygın KK’dir. Kağıdın doyurulması: • Bunun için kağıt kapalı bir kapta suyla doyurulmuş bir atmosferde tutulur. • Uçucu organik çözücü ve kağıt kapalı ortamda dengeleninceye kadar tutulur veya uçucu olmayan çözücü içerisine kağıt yavaşça daldırılır ve hava akımı • Kuvvetli polar veya iyonik maddelerin ayırımı için sulu çözücü sistemler altında (saç kurutma makinası) çözücünün fazlası uzaklaştırılır. kullanılır • Bu amaç için genellikle %40 formamid / %60 etanol kullanılır. • Bu amaç için yaygın olarak kullanılan hareketli fazlar ise: Asit ortam sağlayan : n-bütanol + asetik asit + su (40+10+50) Bazik ortam sağlayan : n- bütanol + amonyak + su (75+8+12) Nötr ortam sağlayan ise : n-bütanol+alkol 9 10 3) Hidrofobik sabit faz (zıt faz kromatografisi) Bu amaçla kağıtlara çeşitli yöntemlerle hidrofobik özellikler kazandırılabilir. Seçilmiş hidrofobik çözücü ile kağıdın basitçe doyurulmasıyla kağıtlara hidrofobik özellik kazandırılmış olur. Modifiye hidrofobik kağıtlar da kullanılabilir • Polar sabit faz ve polar hareketli fazdan oluşan kromatografilere normal kromatografi denir. Zıt faz kr’de kullanılan tipik kombinasyonlar (polarite artışına göre) • Sabit fazın apolar (hidrofobik) olduğu kromatografi türüne de zıt faz a) Likit parafin sabit fazı: benzende %10 oranında hazırlanarak kağıda uygulanır, (hidrofobik) kromatografisi adı verilir. hareketli faz olarak da dimetil formamid+metanol+su (10+10+1,h/h/h) kullanılır • Zıt faz kr. Apolar bileşiklerin ayrılmasında kullanılır. Sistemde hareketli faz b) kerozen: petrol eterinde %10 oranında hazırlanarak kağıda uygulanır mobil faz olarak önce polar bir çözücü (örn su) kullanılır. Örnekteki polar olan olarak izopropanol+su (7+3) veya glasiyel asetik asit kullanılır. bileşenler ayrıldıktan sonra apolar bir çözücü kullanılarak istenen bileşikler ayrılır. c) dimetil formamid: etanolde % 50 oranında hazırlanarak kağıda emdirilir, mobil faz olarak da siklohegzan kullanılır. Bunlardan başka çeşitli kombinasyonlar da kullanılabilir.

KK’nin yapılışı • Örnek ve standartlar aynı kağıt üzerine 1) örneğin kağıda uygulanması birbirleri arasında en az 2.5 cm uzaklık olacak şekilde damlatılmalıdır. • Genellikle 20×20 cm boyutunda • Kağıt kenarları arasında da 2.5 cm boşluk selüloz kağıdı üzerine 2-25 μg örnek olmalıdır. ekstraktını içerecek şekilde, uygun çözücüde çözülerek damlatılır. 2) Kağıdın geliştirilmesi (developmanı) Damlatma işleminde mikropipet • Developman tankı silindirik, dikdörtgen kullanılır. 5μL örnek yeterlidir. prizma ve küp şeklinde olabilmektedir. • Tankın kapağı kapatılmış olmalıdır. • Örnek çapının büyük olmaması için • Developman (geliştirme): kr de çözücü örnek birkaç hamlede verilir. yardımıyla bileşiklerin ayrılması işlemine • Örnek çapının küçük olması istenir developman denir. 13 14 • Tank cam veya metalden yapılmış olabilir. • Tankın boyutları içerisine konacak kağıdın boyutlarına uygun • Kağıdın alt kenarı çözücüye 1-1.5 cm kadar olmalıdır. batmış olmalıdır. • Bu işlem sırasında kağıt çözücüye paralel • Yürütücü çözücü (developman çözücüsü) önceden tanka konmalı ve yürütücü çözücüye doğrudan temas etmeyecek pozisyonda tutularak daldırılmalı ve kesinlikle şekilde kağıt tankın içerisine asılarak tank atmosferi ve kağıt benekler çözücü ile doğrudan temas çözücü buharıyla doyurulmalıdır. etmemelidir. • Çözücü buharıyla doyurulmuş kağıda örnek ve standartlar damlatıldıktan sonra kağıt tekrar tankın içerisine yerleştirilir. 15 16 Kromatogramın değerlendirilmesi • Kağıt tanka yerleştirildikten sonra tankın kapağı hemen kapatılarak çözücünün kağıt üzerinden yükselmesi sağlanır. Çözücü kağıt üzerine 3 cm • Tanktan alınan ve kurutulan kağıt incelenir. Eğer kadar yaklaşınca tankın kapağı açılarak kağıt tanktan çıkarılır. Böylece ayrılan bileşikler gözle görülebiliyorsa kağıdın developmanı tamamlanmış olur. beneklerin Rf (retention factor) değerleri • Kağıdın üzerindeki çözücünün hızla buharlaştırılması gerekmektedir. Aksi ölçülür. halde difüzyon etkisiyle benek çapları büyüyecektir. Rf değeri: bileşiğin aldığı yolun çözücünün aldığı • Kağıt açık havada veya etüvde kurutulur. yola oranıdır.

• Rf değeri 0 ile 1 arasında bulunur • Rf değerleri, standartların Rf değerleri ile • hızlı yürüyen komponentler için alınan mesafe büyük karşılaştırılarak kalitatif analiz yapılmış olur. olacağından Rf değeri büyük, daha yavaş yürüyenler için daha küçüktür. Yarı kantitatif tayin: standartların benek çapı • Rf değeri: veya alanına karşı konsantrasyonla kalibrasyon sıcaklığa grafiği çizilir. Buradan örnek beneğinin çapı kağıdın cinsine veya alanına karşı konsantrasyon bulunur. kullanılan yürütücü karışımın cinsine bağlıdır. • Aynı sistem için Rf değeri sabittir. 19 20 • Eğer kağıt üzerinde ayrılmış bulunan benekler renksiz • Bazı renksiz benekler de kimyasal reaksiyonla görünür hale ve gözle görülemiyorsa bunların incelenmesi için getirilerek incelenir. görünür hale getirilmesi gerekir. Bunun için kağıt UV ışık altında incelenebilir. • Örneğin, kağıt üzerinde ayrılmış bulunan ve görülmeyen aminoasitler ninhidrin ile reaksiyona sokularak görünür hale getirilir. • UV ışıkta benekler belli bir ışıkta belirginleşmeye • Bunun için kağıt üzerine reaktif püskürtülür veya kağıt reaktif başlar. Beneklerin bulunduğu yer bir kurşun kalemle çözeltisine daldırılır. işaretlenir. 21 22 İki boyutlu (two dimentional) kromatografi KK’sinin gıda analizlerinde uygulamaları • Bir karışımda Rf değerleri birbirine çok yakın bileşikler • Günümüzde KK daha çok kalitatif amaçlarla belli bir bulunuyorsa bunların ayrılmasında kullanılır. komponentin karışımdan ayrılması için kullanılır. • Kağıdın kenarlarından 2.5 cm içeride bir köşesine damlatılan • Kağıt üzerinde ayrılmış olan benek kesilerek uygun bir örnek önce 1. çözücü ile yürütülür. Daha sonra aynı kağıt çözücüde ekstrakte edilip bileşen başka teknik kurutulur ve 90 derece döndürülerek, kısmen ayrılmış analizlerde de kullanılabilir. beneklerin daha iyi ayrılmasını sağlamak için ikinci (farklı) bir çözücüde geliştirilir. Böylece iki boyutta ayrılma ile örnek bileşenlerinin daha iyi ayrılması sağlanmış olur.

• Karbonhidratlar da KK ile ayrılabilir. Örn diyet • Baharatlarda bulunan fenoller KK ile ayrılabilir. gıdalardaki glikoz, fruktoz, sakkaroz, ve laktoz belirlenebilir. • Doğal ve yapay sirke KK ile belirlenebilir. Doğal sirkede aminoasitler vardır, ancak sentetik • Sucuk, sosis ve diğer et ürünlerine süt tozu katılıp sirkede yoktur. KK ile aminoasitler belirlenerek katılmadığı, laktoz hidroliz edilip galaktoz ve glikoza sirkenin doğal olup olmadığı belirlenebilir. dönüştürüldükten sonra KK ile belirlenebilir. • Bazı meyve sularındaki şekerlerde bu yöntemle belirlenebilir. 25 26 Ince Tabaka Kromatografisi (İTK) Thin layer Chromatography (TLC) • İTK’de ayırmada genel kural: örneği oluşturan bileşenlerin polarlık derecelerine uygun polarlıkta • İnce tabaka kromatografisi, bir “katı –sıvı adsorpsiyon çözücü seçmektir. kromatografisidir.” • Çoğu kez apolar bileşikler için kuvvetli aktif • sabit faz : bir plaka üzerine ince bir tabaka halinde sıvanmıs katı adsorbant maddedir. adsorbantlar; Polar bileşikler için ise zayıf aktif adsorbantlar seçilir. • Hareketli faz: sıvı • Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyisi, • Yürüme hızı: ayrılacak bileşenin, katı fazın ve asağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine çözücünün polaritesine bağlıdır. daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür. 27 28 İTK’sinin KK’sine üstünlükleri • Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina,silika jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. • 1) İTK’de silikajel, celite, alüminyum oksit, gibi inorganik ve • İTK’de dolgu maddeleri cam veya plastik plaka üzerine 1 selüloz, poliamid gibi organik adsorbantlarla ince tabakalar mm’den daha az kalınlıkta yayılarak kaplanır. oluşturularak ayırma gerçekleştirilebileceği halde, KK’de selüloza bağlı kalınır. • Plakalar genellikle 20×20 cm boyutundadır. • İTK’de ayrılacak maddeye göre uygun adsorbant seçme kolaylığı vardır.

…