Bu analiz talimatı bebek mamalarındaki nitrit ve nitrat miktarını tesbit etmek amacıyla numunenin sıcak su ile ekstrakte edilip, proteinlerin çöktürülerek filtre edilmesinden sonra metalik kadmiyum ile nitratın nitrite indirgenmesi; sülfanilik asit ve N-1-naphthylethylenediamonium diclorid çözeltileriyle oluşturulan kırmızı rengin yoğunluğunun spektrofotometrede ölçülmesini kapsar.
2.0 PRENSİP
Örnekteki nitratın sıcak su ile ekstrakte edilerek, proteinlerin çöktürülmesini takiben nitratların kadmiyum ile nitrite indirgenmesi olup, bu işlemi sülfonamid ve N-1-naftiletilendiamin dihidroklorit ilavesi ile kırmızı renk oluşumunun 538 nm’de spektrofotometrik olarak okunmasıdır.
3.0 ALET EKİPMANLAR
Balon joje,
Huni,
Beher,
Pipet,
Cam baget,
Filtre kağıdı( 20-25mm ve 2,5-8mm por çapında , Whatman no 4 ve no 40-42 veya muadili)
Spektrofotometre,
Spektrofotometre küveti,
Kaynar su banyosu.
4.0 KİMYASAL MADDELER
Zn tozu
Carrez 1 :Potasyum ferrosiyano trihydrate K4Fe(CN)6.3H2O dan 15g tartılır.Su ile 100 ml ye tamamlanır
Carrez 2:Çinko sulfate ZnSO4.3H2O dan 30g tartılır ve su ile çözülür.100 ml ye tamamlanır.
Doymuş boraks çözeltisi: Di sodyum tetra borate decahydrate Na2B4O7.10H2O dan 5 g tartılır 100 ml ılık su içinde çözündürülür.Oda sıcaklığına soğutulur.
Kadmiyum sülfat 3CdSO4.8H2O dan 10 g tartılır 100 ml suda çözülür.
Konsantre amonyak : %25’lik
Nitrit solüsyonu: 1000mg/L nitrit içeren hazır stok solüsyondan:
1 numaraları bebek mamaları için TGK’de(Türk Gıda Kodeksi) belirtilen 0,1 mg/l lik standart hazırlanır.(1/100 buradan 1/100 seyreltmesi ile) Hazırlanan bu 0,1 mg/L lik standart numunenin seyreldiği oranda seyreltilir.(5/100 buradan 10 ml alınıp renk solüsyonları eklenerek absorbans ölçümü yapılır.)
Nitrat solüsyonu: 1000 mg/L nitrat içeren hazır stok solüsyondan:
1 numaralı bebek mamaları için TGK’de belirtilen 40ppm ‘lik standart hazırlanır.(4/100 )Hazırlanan bu 40 ppmlik standart , numunenin seyreltildiği oranda seyreltilir.(5/100 buradan 10 ml nitratın nitrite indirgenme reaksiyonuna tabi tutulur.(10/50). Buradan 10 ml alınıp renk solüsyonları eklenerek absorbans ölçümü yapılır.
2 numaradan büyük mamalar için 250 ppmlik standart hazırlanıp numune kadar seyreltilir.1000ppmlik standartdan 1,25 ml /100ml ye seyreltilir.Buradan 10 ml alınıp nitratın nitrite indirgenmesi reaksiyonuna tabi tutulur.(10/50).Buradan 10 ml alınıp renk solüsyonları eklenerek absorbans ölçümü yapılır.250 ppm bu seyreltme ile okunamayacak kadar absorbans veriyor.
Sülfanilik asit çözeltisi: NH2C6H4SO2NH2 sülfanilik asitden 600 mg tartılır 50 ml sıcak suda çözülür.Soğutulur.20ml glaciel asetik asit eklenir.100 ml’ye sulandırılır.
N-(1-naphtyl) etylenediamonium dichlorid çözeltisi (NED): C12H16Cl2N2.CH3OH den 20 mg tartılır 20 ml glaciel asetik asitde çözündürülür.100 ml’ye su ile tamamlanır. Solüsyon iyi kapanan kahve renkli şişede saklanır.Buzdolabında bir haftadan fazla olmamak kaydıyla saklanabilir.
UYGULAMA
Numune homojenize edilir. 5 g numune 100 ml’lik behere tartılır.10 ml doymuş boraks solüsyonu ve 70 °C’den soğuk olmayan 50 ml su eklenir. Kaynar su banyosunda beher içeriği 15 dakika ısıtılır ara sıra karıştırılır. Beher içeriğinin oda sıcaklığına gelmesi beklenir. 2 ml carrez 1 eklenir ve karıştırılır. 2 ml carrez 2 eklenir ve karıştırılır. Erlenmayer içeriği 100 ml lik balon jojeye taşınır ve su ile çizgiye tamamlanır.30 dakika oda sıcaklığında bekletilir.
Dikkatle berrak kısım çöken kısımdan ayrılarak yelpaze şeklinde katlanmış whatman no:4 filtre kağıdından süzülerek berrak bir solüsyon elde edilir. (Solüsyon berrak değilse carez çözeltilerinden kullanılan hacim 10 ml’ye kadar arttırılabilir.)
Nitrit tayini için bu süzüntüden 10 ml bir deney tüpüne alınır.Hazırlanan nitrit standardındanda 10 ml başka bir tüpe alınır. Tüplere sülfanilik asit solüsyonu eklenir 5 dakika karanlıkta bekletilir. 5 ml NED solüsyonu eklenir karıştırılır. 10 dakika karanlıkta bekletilir.538 nmde suya karşı absorbansı okunur.
Nitrat tayini için süzüntüdeki nitratın nitrite indirgenmesi şöyle yapılır; numune için , bir tanede kör için, bir tanede standart için 600 mg Zn tozu ayrı ayrı tartılıp 50 ml’lik balon jojelere alınır ve toz balonun tabanına yayılır. 4 ml kadmiyum sülfat solüsyonu dikkatle balonun çeperlerine değmeden direk Zn tozu üzerine ilave edilir. Yeni hazırlanmış metalik kadmiyum 10 dakika hareket ettirilmeden bekletilir. Balonlara 2 ml %25 ‘lik amonyak ve 10 ml numune solüsyonu ve kör balonuna da 10ml saf su eklenir. Kadmiyumu uzaklaştırmak için balonlar 1 dakika karıştırılır.10 dakika hareket ettirilmeden bekletilir. Hacme tamamlanır ve filtre edilir (whatman no:40-42). Kullanımdan sonra balon içerisindeki kalıntılar konsantre HCl ile atık sişesine alınır.Renk reaksiyonundan sonra atıklarda bir başka şişede toplanır. 10’ar ml metalik kadmiyum ile indirgenmiş numune filtratı , indirgenmiş standart çözeltisi ve indirgenmiş kör 25 ml’lik deney tüplerine alınır. NED ve sülfanilik asit çözeltilerinden 5’er ml kullanımdan hemen önce karıştırılarak filtratların üzerine eklenir.15 dakika renk oluşumu için beklenir. Numune solüsyonunun ve standardın absorbansları spektrofotometrede 530 nmde 1 cm lik küvetler kullanılarak hazırlanan köre karşı ölçülür.
Analiz aynı gün içinde tamamlanmalıdır.
HESAPLAMA
Nitrit standardının 538 nmdeki absorbansı 1 nolu bebek mamalarında numune absorbansından büyük olmalıdır.Bu durumda sonuç Nitrit(mg/kg):<0,1 şeklinde hesaplanır.Eğer numune absorbansı standart absorbansından büyükse orantı kurularak numunedeki nitrit miktarı hesaplanır.
Nitrat miktarı tayininde ise.Bulunan absorbans değeri 1 nolu mamalarda numune absorbansından numunedeki nitrit absorbansı çıkarılır.Bulunan absorbans değeri 40 ppmlik standart absorbansından küçük olmalıdır , 2 nolu mamalarda nitrit düzeltme işlemi yapılmaz .TGK bebek devam formülleri için sadece nitrat bahsi yapmaktadır.Numune absorbansı 250 ppmlik standart absorbansından küçük olmalıdır. Bu durumda sonuç Nitrat (mg/kg):<40 yada <250 diye yorumlanır.Eğer bulunan absorbans değerleri standart absorbanslarından büyükse standart konsantrasyonlarına ve absorbanslarına orantı kurularak numunedeki nitrat miktarı mg/kg olarak hesaplanır.
KAYNAK
AOAC Official methods 993.03-2000 ,
AOAC Official methods 973.31 ,
Boehringer Mannheim/R-Biopharm Nitrate UV method for the determination of nitrate in foodstuffs and other materials
