5.4.1. İlgili Bileşiklerin En Düşük Tespit Edilebilir (Limit of Detection) ve En Düşük Hesaplanabilir (Limit of Quantitation) Limiti
Linearity(Doğrusallık)
5.4.3. Specivity (Seçicilik)
5.4.4. Precision (Kesinlik)
5.4.4.1. Repeatability (Tekrarlanabilirlik)
5.4.4.2. Reproducibility (Tekrar Üretebilirlik
5.4.5. Accurity (Doğruluk)
HESAPLAMA
7. REFERANS
AMAÇ VE KAPSAM :
Katkı Kalıntı laboratuvarında, bal, arı sütü ve peteklerde naftalin kalıntı miktarını tespit etmektir.
PRENSİP :
Solid Phase Micro Extraction ( Spme ) ile numunede naftalin kalıntı miktarının tespiti amacıyla, Fiberin mikroekstraksiyondaki iyonik gücünü kullanarak numunedeki naftalinin elde edilerek tayin edilmesi esasına dayanmaktadır.
ALET – EKİPMAN VE AKSESUARLAR :
3.1. 1 ve 5 ml’lik pipetler
3.2. Ölçülü balonlar; şilifli, kapaklı, 100 ml’lik
Ultrasonik Su Banyosu
Ultra toraks
Hassas Terazi
SPME Fiber Assembly (Supelco – Lot:P305674E)
Manuel Holder (Supelco – 995-0125)
Graduated Screw Top Vial (Supelco – Lot: 5796)
GC-MS
KİMYASAL MADDELER :
Analiz sırasında, yalnızca aşağıda belirtilen analitik saflıktaki kimyasallar ve ultra saf su kullanılmalıdır.
Çalışma Çözeltileri : 400 ppm’ lik stok çözeltiden 0,1 – 1,0 – 5,0 – 10,0 ppb olacak şekilde hekzan ile seyreltilerek hazırlanır. Çalışma çözeltilerinin hazırlandığı hekzan aynı metotta GC/MS’ e 1 ml enjeksiyon yapılarak naftalin olup olmadığına bakılır. Bu işlem 5 kez tekrarlanarak elde edilen alan standartların alanından düşülür.
KALİBRASYON :
Minimum standart konsantrasyonu sıfır olmak üzere, aşağıdaki yol izlenerek altı noktalı bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır.
Standart Çalışma Çözeltisi: Standart stok çözeltiden 0.5, 1.0, 2.5, 5 ve 15. ppm MeOH/su karışımı ile tamamlanarak hazırlanır.
Standart çözeltiler, belirlenmiş koşullara göre GC/MS’ ye enjekte edilir. Standart konsantrasyonuna karşılık gelen alıkonma süresi, pik yüksekliği ve alan kaydedilir. Herbir standart çözelti için kaydedilen pik yüksekliği veya alan değerleri grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrisi hazırlanır.
UYGULAMA :
5.1. Örnek Hazırlama:
Önceden analizde kullanılacak su direk olarak 10 ml vial içerisine konularak SPME ile numune gibi analiz edilir. Sudaki naftalin miktarı hesaplanarak kör olarak kullanılır. Numuneden elde edilen alandan suyun alanı da çıkarılarak hesaplama yapılır. 1 g bal özel kapaklı 40 ml hacimli vialler içine tartılır. Saf su ile 10 ml’ ye tamamlanır. Vialin kapağı kapatılır ve iyice çalkalanarak karıştırılır. Enjektöre benzeyen (holder), ucunda uçucu kompenentleri absorblama yeteneğine sahip fiber ( 100µm çapında polidimetilsiloksan ) vial kapağından içine sıvı kısma değmeyecek şekilde sokulur . Ultrasonik banyoya konur ve ısı kısmı çalıştırılarak yarım saat bekletilir. Süre dolunca ultrasonik banyo kapatılarak Spme vialden çıkarılır.
GC/MS enjeksiyon bloğuna sokulur, start verilir ve 5 dakika sonra Spme çıkarılır. Eğer örnekte naftalin varsa retention time 9-12 dakikalar arasında target iyonu 128, 129, 102, 127 olan pik naftalin olarak ekstraction iyon kromatogramdan standarttaki iyonların abundans oranıyla karşılaştırıldıktan sonra onaylanıp kabul edilir ve alanı tespit edilir.Standardın pik alanıyla, örneğin pik alanı karşılaştırılarak hesaplama yapılır.
Analizden sonra cihazın inlet bloğunun sıcaklığı 280 °C’ ye çıkarılarak fiber inlete sokulur. 30 ile 45 dakika arası bu sıcaklıkta termal temizlik yapılır. Fiber kesinlikte solventlerle temizlenmemelidir; sadece ısıyla temizlenebilir. Temizleme işleminden sonra inlet sıcaklığı 200 °C’ ye düşürülerek cihaz üzerinde analiz başlatılır. Fiberin temizlenip temizlenmediği naftalin pikinin gözlenmesiyle tespit edilir. Gerekirse temizleme işlemi tekrarlanabilir. Bu şekilde fiber 40-50 analizde kullanılabilir.
5.2. Kromatografik Şartlar:
Cihaz : GC/Mass
Kolon Koşulları: HP- 5 MS
Const pressure
Pressure: 75
Flow: 1.3 ml/ dak.
Solvent Delay: 5 dakika
Kütüphane: Toxicology
Inlet Temperature : 200 0C
Oven Temperature : 500C’ de 2 dakika
100C/ dakika artışla 2500C Toplam süre 22 dakika
GC/MS Modu: SIM
Gerekli cihazların kullanımı cihaz kullanım talimatlarına göre yapılır ve kayıtların girişi KKL-SR-01 sürecine göre yapılır.
5.3. GERİ ALMA :
Naftalin İlavesi : 6 defa 0.1 ppb ve 10 ppb standart numuneye eklenir ve homojen olacak şekilde ultra toraksta karıştırılır.
Numune: Naftlin içermeyen bal
İşlem : Numuneye uygulanan ekstraksiyon işlemi uygulanır.
Hesaplama: Sonuçlar hazırlanan standart çözeltilerinin linearitesi ile kontrol edilir.
R = (S x 100) / Se
S : Standart ilave edilmiş numuneden elde edilen pikin yüksekliği veya alanı
Se : Standart çözeltiden elde edilen pikin yüksekliği veya alanı
5.4. METOT PERFORMANSI (VALİDASYON):
5.4.1.İlgili Bileşiklerin En Düşük Tespit Edilebilir (Limit of Detection) ve En Düşük Hesaplanabilir (Limit of Quantitation) Limiti:
LOD ve LOQ signal-to-noise oranına göre hesaplanır.
LOD : Signal-to-noise oranı olarak, bilinen aktif konsantrasyonun test sonucunun, blank numune test sonucu ile karşılaştırılarak minumum konsantrasyonun tespit edilmesiyle hesaplanır. Genellikle 3:1 kabul edilebilir orandır.
LQD : Signal-to-noise oranı olarak, bilinen aktif konsantrasyonun test sonucunun, blank numune test sonucu ile karşılaştırılarak minumum konsantrasyonun hesaplanmasıyla tespit edilir. Genellikle Signal-to-noise oranı 10:1’dir.
En az 5 farklı derişimde numune enjeksiyonu gözlenmesi gerekmektedir. LOD ve LQD hesaplanması amacıyla 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 ppb’ lik standartlardan 5’er kez enjeksiyon yapılacak(5X5=25) ve en az beş farklı konsantrasyonda gözlemlenerek sonuç 0.1 ppb olarak tespit edilmiştir.
5.4.2. Linearity(Doğrusallık) :
Belirlenen derişimler arasında (genellikle numune derişiminin % 60-% 140) 5 ayrı standart hazırlanarak her standart 2 defa enjeksiyon yapılarak dedektör yanıtına göre derişim/alan grafiği çizilir. Bu derişim aralığının lineer olduğu ve çalışma derişiminin lineer aralığın içinde bulunduğu gösterilir.
1, 2, 3, 5, 10 ppb’ lik standarttan 5’ er kez enjeksiyon yapılacak (5X5=25) Belirlenen derişimler arasında kalibrasyon grafiği çizilerek bu derişimlerin linear olduğu ve çalışma derişiminin linear aralığın içinde olduğu gösterilecek. Aynı zamanda minimum ve maksimum linear aralık belirlenecek.
5.4.3. Specivity (Seçicilik) :
Placebo (naphtaline içermeyen) numunesi metotta belirtildiği gibi hazırlanarak numune gibi analiz yapılır. Naphtaline piki alıkonma zamanında placebo’ dan gelen herhangi bir pik olmadığı rapor edilir.
5.4.4. Precision (Kesinlik) : Numunelerden 6 tartım alınarak ayrı ayrı numuneler hazırlanır ve analiz edilir. Bu işlem farklı günlerde, farklı cihaz ve kolon kullanılarak iki analist tarafından yapılır.
5.4.4.1. Repeatability (Tekrarlanabilirlik) : Aynı numuneden en az 10 tane olmak üzere toplam 10 adet örnekten 2’ şer paralel hazırlanarak, aynı kişi tarafından 2’şer kez cihaza enjeksiyon yapılacak.(10 X2=20 adet örnek, 20X2=40 enjeksiyon) Standart sapma hesaplanacak.
5.4.4.2. Reproducibility (Tekrar Üretebilirlik): Aynı örnekler farklı kolonda veya farklı kişiler tarafından analiz edilecek.
5.4.5. Accurity (Doğruluk) :
Numune hazırlığında belirtildiği gibi aktif madde içeriği teorik naftalin miktarının % 80, % 100, % 120’ si olacak şekilde placebo’ ya ilave edilerek numuneler hazırlanır:
Recovery yapılarak geri alım oranları %80 – %120 arasında olacak şekilde 1, 3, 5, 10, 20 ppb’ lik standarttan örneğe ilave edilerek % verim bulunacak. Bu işlem 5 adet balda ayrı ayrı yapılacak ve 5’ er kez tekrarlanarak 2’şer enjeksiyon yapılacak. Her farklı standart konsantrasyondan recovery madde 13’ deki gibi %’si hesaplanacak.
6.HESAPLAMA :
Nafatalin standardında ve analiz edilen numunede bulunan naftalin konsantrasyonu hesaplanır. Hesaplama sırasında geri alma yüzdesi dikkate alınmalıdır.
Analiz Miktarı (ppm) = (A2 / A1) x (c1 / C2) x 100 x SF
A2 : Numunenin pik alanı
A1 : Standardın pik alanı
c1 : Standardın konsantrasyonu (ppb)
C2 : Tartılan örnek miktarı (g)
SF : Seyreltme Faktörü
7.REFERANS :
In House Method
Jounal Of Chromotography A, 829 (1998) 269-277. Home Method
